Методы генетики человека

В.Ф. Черник

ГЕНЕТИКА

Пособие к УМК

Генетика (от греч.genesis – происхождение)–наука, изучающая универсальные для всех живых организмов законы наследственности и изменчивости на всех уровнях его организации.

Задачи генетики: формирование знаний об основных закономерностях наследственности и изменчивости, которые позволят осмыслить наследственную патологию; изучение особенностей структурно-функциональной организации отдельных генов, создание новых технологий рекомбинантных ДНК и их применение в решении практических задач; исследование и расшифровка генома человека; разработка методов исследования ДНК с целью проведения диагностики наследственных заболеваний; генодиагностика болезней до начала их клинических проявлений; разработка методов генотерапии (лечения с помощью генов); создание для каждого человека «генетического паспорта», содержащего информацию о генах, определяющих его предрасположенность к различным заболеваниям и др.

Методы генетики человека

Клинико-генеалогический метод – метод составления и анализа родословных с целью установления закономерностей наследственной передачи нормальных и патологических признаков. Предложен Ф. Гальтоном в 1883 г. В медицинской генетике его называют клинико-генеалогическим. С помощью этого метода прослеживается наследование нормального или патологического признака в семье с указанием родственных связей между членами родословной. Этот метод широко применяется при медико-генетическом консультировании. Сущность метода заключается в выявлении родственных связей и прослеживании патологического признака среди родственников. Метод включает три этапа. Первый этап – сбор сведений о родственниках пробанда (пробанд – человек, который обратился в врачу-генетику). Пробанд обычно болен наследственным заболеванием или является носителем патологического признака, наследование которого необходимо изучить. Сбор генетической информации проводится методом опроса, анкетирования. Второй этап – составление родословной, которое сопровождается краткой записью о каждом члене родословной и о его родстве по отношению к пробанду. Наиболее точные данные по составлению родословной можно получить с помощью анкетирования родственников и их лабораторно-генетического и клинического обследования. Третий этап – анализ родословной.

Генеалогический метод позволяет определить тип наследования признака, генотипы членов родословной, пенетрантность гена, механизм взаимодействия генов, наличие изменения наследственного материала (мутационного процесса), расчет риска рождения больного ребенка и риска наследственного заболевания для потомства, анализ локализации генов на хромосомах. При построении родословных необходимо соблюдать следующие правила: 1) необходимо собрать данные не менее, чем о трех поколениях; 2) родословную начинают строить с пробанда; 3) каждое поколение нумеруется римскими цифрами слева; 4) символы, обозначающие членов родословной одного поколения, располагаются на горизонтальной линии и нумеруются арабскими цифрами.

Изучены следующие типы наследования признаков: аутосомно-доминантный; аутосомно-рецессивный; сцепленный с Х-хромосомой доминантный; сцепленный с Х-хромосомой рецессивный; голандрический (См. Главу 8 «Наследственные генные болезни»).

Для определения типа наследования признака учитывают: 1) во всех ли поколениях и как часто среди членов родословной встречается признак; 2) одинакова ли частота встречаемости признака у обоих полов и если нет, то у какого пола признак встречается чаще; 3) детям какого пола передается признак от больного отца и от больной матери; 4) есть ли семьи, в которых от больных родителей рождаются здоровые дети и, наоборот; 5) какая часть потомства имеет наследуемый признак в семьях, где болен один из родителей. Таким образом, клинико-генеалогический метод используется для диагностики наследственных болезней и медико-генетического консультирования.

Цитогенетический метод – это изучение кариотипа при помощи микроскопии, что позволяет обнаружить геномные и хромосомные мутации и определить генетический пол организма.

Этапы метода:1. Культивирование клеток (лимфоциты, фибробласты) на искусственных питательных средах. Кровь берется у взрослых из вены, у новорожденных – из пальца. 2. Добавление в питательную среду фитогемагглютинина для стимуляции митотических делений клеток. 3. Добавление в питательную среду колхицина для остановки митотического деления клеток (колхицин разрушает клеточное веретено и усиливает спирализацию (конденсацию) хромосом. 4. Обработка клеток гипотоническим раствором NaCl для разрушения клеточной оболочки и получения «россыпи» хромосом. 5. Окрашивание хромосом специфическими красителями. Чаще применяется сплошная окраска по Гимзе для определения количества хромосом и выявления геномных мутаций. Для выявления хромосомных мутаций используют дифференциальную окраску, в результате которой хромосомы становятся поперечно исчерченными. Расположение и длина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы, поэтому можно точно идентифицировать гомологичные пары и выявить структурные перестройки хромосом. Для дифференциальной окраски хромосом эффективен G-метод – окрашивание красителем Гимзы после предварительной обработки хромосом раствором протеазы (трипсина); С-метод – окрашивание раствором гидроокиси бария при 60 ºC в красителе Гимзы; Т-метод – окрашивание азотнокислым серебром. 6. Изучение хромосом под микроскопом и их фотографирование. 7. Составление идиограммы и ее анализ. Метод широко применяется в медико-генетическом консультировании для пренатальной диагностики хромосомных болезней.

Близнецовый метод предложен в 1876 г. Ф. Гальтоном. Это изучение закономерностей наследования признаков на близнецах (потомки одних родителей, развившиеся совместно за одну беременность). Метод основан на сравнении наследуемых признаков у разных групп близнецов, исходя из их сходства или различия. Включает следующие этапы: 1) составление выборки для исследования близнецов; 2) диагностика монозиготности или дизиготности близнецов; 3) выбор признака и установление степени конкордантности его в группах моно- и дизиготных близнецов; 4) установление соотношения роли наследственности и среды в формировании признака.

Монозиготные близнецы (МБ), – или однояйцевые близнецы (ОБ) развиваются из одной яйцеклетки, оплодотворенной одним сперматозоидом. Они имеют одинаковый генотип, но несколько могут отличаться по фенотипу, что обусловлено влиянием факторов внешней среды. Дизиготные близнецы, (ДБ) – или разнояйцевые близнецы (РБ) развиваются в результате оплодотворения разными сперматозоидами двух и более яйцеклеток. Они имеют разный генотип.

Врач-генетик проводит исследование конкордантности (сходства) у монозиготных и дискордантности (несходства) у дизиготных близнецов по многим признакам, в том числе и по группам крови. Осуществляется также сравнительная оценка роли наследственности и среды в формировании признаков у монозиготных близнецов. Сравнение ОБ с одинаковой средой (социальные условия, физические факторы, тип питания и др.) и с разной средой дает возможность судить о влиянии среды на их организм. Сравнение ОБ и РБ с одинаковой средой позволяет выявить роль наследственности в развитии признаков. Такое изучение проводится на большой группе близнецов.

Для количественной оценки роли наследственности и среды в развитии того или иного признака используют коэффициент наследуемости, который вычисляется по формуле Хольцингера:

КМБ % – КДБ %

Н = ––––––––––––––,

100 % – КДБ%

где Н – доля наследственных факторов (коэффициент наследуемости), КМБ и КДБ – конкордантность, соответственно, монозиготных и дизиготных близнецов в процентах. Если Н больше 0,5, то в формировании признака большую роль играет генотип, если Н меньше 0,5, то развитие признака обусловлено факторами внешней среды.

С помощью близнецового метода изучена наследственная предрасположенность к многим заболеваниям (ишемическая болезнь сердца, ревматизм, язвенная болезнь, шизофрения, сахарный диабет и др.). Выявлена конкордантность близнецов для разных групп болезней (таблица 1).

Таблица 1. Конкордантность близнецов для групп болезней

Биохимические методы. Биохимические методы позволяют диагностировать наследственно обусловленное нарушение обмена веществ (сахарный диабет, фенилкетонурия, галактоземия и др.) и выявлять гетерозиготного носителя заболевания обмена веществ.

Многие наследственные заболевания обмена веществ – генные мутации связаны с ферментопатиями (нарушением структуры ферментов, участвующих в обменных процессах). Накопление промежуточных продуктов обмена и активность ферментов определяются с помощью биохимических методов, позволяющих диагностировать наследственные болезни обмена веществ. Для биохимических анализов требуется специальная лаборатория, где имеется соответствующая аппаратура. Материалом биохимической диагностики являются: моча, кровь, культуры клеток фибробластов и лимфоцитов.

Широко используются количественные биохимические методы (нагрузочные тесты), с помощью которых можно выявить гетерозиготных носителей дефектных генов, например фенилкетонурии. Обследуемому человеку вводят внутривенно определенное количество аминокислоты фенилаланина и через каждый час определяют ее концентрацию в крови. Если человек доминантная гомозигота (АА), то быстро концентрация снижается до контрольного уровня (уровень, который был до введения фенилаланина). Если человек гетерозиготен, то снижение концентрации идет в два раза медленнее, так как у гетероозигот содержание фермента вдвое ниже, чем у доминантных гомозигот.

Популяционно-статистический метод предназначен для изучения генетического состава популяции человека (частоты генов и генотипов, включая частоту наследственных болезней; закономерностей мутационного процесса; роли наследственности и среды в возникновении болезней с наследственной предрасположенностью). Данные о частоте рецессивных генов и их гетерозиготных носителей имеют большое значение, так как способствуют организации профилактических мероприятий в данной популяции человека. Генетическое изучение популяций человека включает изучение демографических показателей (рождаемости, смертности, возрастной и половой структуры); некоторых особенностей популяции: популяция панмиксичная (случайные браки), или инбредная (высокая частота кровнородственных браков).

Большие популяции характеризуются генетическим полиморфизмом (АА, Аа, аа) по определенному признаку и панмиксией. При условии, если популяция идеальная: велика по численности, в ней существуют случайные браки, отсутствуют мутации по данному признаку, отсутствует приток и отток генов, то возможны 9 вариантов браков. Генетические записи этих типов браков следующие: 1. АА х АА; 2. АА х Аа; 3. АА х аа; 4. Аа х АА; 5. Аа х Аа; 6. Аа х аа; 7. Аа х АА; 8. Аа х Аа; 9. аа х аа. Генетические записи потомства следующие: 4АА + 8 Аа + 4аа или АА + 2Аа + аа. В идеальной популяции соотношение частот генов и генотипов – величина постоянная из поколения в поколение (закон Харди-Вайнберга): АА + 2Аа + аа= 1.

Молекулярно-генетические методы – это методы изучения структуры ДНК для диагностики заболевания. В 1983 г. американским ученым К.Б. Мюллисом был предложен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий обнаруживать и многократно копировать короткие участки ДНК и гены и использовать их для анализа. Для проведения реакции необходимо точное знание нуклеотидной последовательности искомого фрагмента ДНК. Этапы молекулярно-генетического исследования:

1. Выделение тотальной или геномной ДНК из клеток и накопление фрагментов (участков) ДНК, которые необходимо исследовать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Подготовка биоматериала. Для получения ДНК используются лейкоциты периферической крови (1 мл), клетки амниона, хорион (30 г), клетки слизистой ротовой полости (по 5–10 мг культуры клеток).

3. Исследование небольшого фрагмента ДНК. Для точного анализа необходимо большое количество таких фрагментов, поэтому их нужно размножить, то есть получить их копии с помощью полимеразной цепной реакции. Реакция осуществляется в пробирке с помощью фермента ДНК-полимеразы (он выделен из термофильных бактерий и отличается устойчивостью к высокой температуре), а также набора четырех нуклеотидов А, Т, Г и Ц и нуклеотидных праймеров, которые представляют собой короткие, искусственно синтезированные длиной в 20–30 нуклеотидов одноцепочечные фрагменты ДНК (5’–3’), комплементарные 3’- концевым последовательностям копируемой ДНК-матрицы (к-ДНК). Они значительно короче копируемой ДНК-матрицы.

4. Амплификация (умножение) фрагмента ДНК с помощью метода ПЦР. ПЦР включает три стадии: денатурацию, гибридизацию и полимеризацию. Денатурация ДНК – процесс разъединения двойной спирали на комплементарные одноцепочечные нити (первая стадия ПЦР). При денатурации(температура 90 ºC) в течение 15 с разрушаются водородные связи между нитями ДНК и образуются две одноцепочечные молекулы ДНК из одной двуспиральной молекулы ДНК. В таком состоянии каждая цепочка служит матрицей для репликации. Гибридизация – образование двойных цепей ДНК, или копирование одноцепочечных молекул ДНК. Реакция протекает в течение 30 с при снижении температуры с 90 ºC до 50 ºC при участии фермента термостабильной ДНК-полимеразы. В результате происходит гибридизация матричных цепей ДНК с нуклеотидными праймерами – короткими искусственно синтезированными фрагментами ДНК и удвоение количества исследуемого гена. Полимеризация – третья стадия цикла ПЦР, в ходе которой при увеличении температуры с 50 ºC до 72 ºC ДНК-полимераза присоединяется к 3’-концам праймеров и удлиняет оба праймера с их 3’-концов до размеров матричной нити ДНК Рис. 1). В результате этого праймеры достигают размеров копируемой ДНК-матрицы и количество ДНК удваивается. В приборе-амплификаторе полимеразная цепная реакция протекает в течение 90 с.5. Разрезание ДНК на фрагменты осуществляемое рестриктазами, и получение набора фрагментов длиной в 4–6 нуклеотидов. Деление ДНК на части необходимо, так как проводить анализы с огромными молекулами ДНК невозможно.

Рис.1. Последовательные стадии амплификации (размножения) фрагмента ДНК с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)

6. Электрофорез ДНК. Электрофорез обеспечивает разделение полученных фрагментов в толще специального геля в постоянном электрическом поле. Далее на поверхность геля кладут нитроцеллюлозный фильтр. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и оказывается на его поверхности. Расположение одноцепочечных фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

7. Визуализация и идентификация фрагментов ДНК в геле. Для того, чтобы выявить нужные фрагменты, проводят гибридизацию одноцепочечными фрагментами ДНК – меченым генетическим зондом (ДНК-зонд). Его используют в качестве маркера дефектных мутаций. ДНК- зонд – короткий отрезок ДНК, состоящий из 16–30 пар нуклеотидов, известной структуры, меченый флюоресцентным соединением, в результате чего происходит гибридизация (взаимодействие) комплементарных цепей ДНК-зонда и одноцепочечных фрагментов на фильтре.

Генная дактилоскопия – выявление вариаций в числе и длине тандемных повторов ДНК. Для каждого человека характерен присущий только ему вариант тандемно повторяющихся последовательностей нуклеотидов, как и отпечатков пальцев. Для проведения генной дактилоскопии сначала из клеток выделяют ДНК и с помощью рестриктаз разрезают ее на фрагменты. Среди фрагментов выявляют минисателлиты длиной 9–64 пар нуклеотидов. Все фрагменты подвергаются электрофорезу в геле. Далее применяют генетический меченый олигозонд – короткий участок ДНК, имеющий 16–30 пар нуклеотидов, гибридизация с которым позволяет идентифицировать фрагменты: выявить вариации в числе и длине тандемных повторов ДНК, замену отдельных пар оснований.

Методы генетического анализа – совокупность методов изучения наследственных свойств организма. Например, ДНК-диагностика позволяет выделить и анализировать гены, устанавливать в них последовательность нуклеотидов (секвенировать), создавать большое количество их копий, транскрибировать и транслировать гены. В настоящее время широко применяется метод ДНК-диагностики многих наследственных заболеваний человека. Генетического картирования – метод составления генетических карт определенного организма. Современные методы исследования в области генетики человека базируются на ранее хорошо разработанных молекулярно-генетических, биохимических, цитогенетических методах исследования.

Дерматоглифический метод – метод, позволяющий анализировать рельеф кожи на пальцах, ладонях, подошвах. Служит для экспресс- диагностики некоторых наследственных заболеваний.