Створення та скринінг геномних бібліотек

Раніше було розглянуто принципи клонування фрагмента ДНК. Але звідки береться цей фрагмент? Для того, щоб працювати з певною ділянкою ДНК (наприклад, певним геном) спочатку здійснюють клонування великої кількості різноманітних фрагментів геному створюють бібліотеку клонів, серед яких уже шукають потрібний.

Стандартна процедура створення бібліотеки – метод дробовика (shotgun) – розпочинається з часткової (протягом обмеженого часу) обробки всієї геномної ДНК певною рестриктазою – для того, щоб отримати набір різноманітних фрагментів, які перекриваються, причому, середня довжина цих фрагментів становить ~20 тис. пар основ (рис. 5). Усі такі фрагменти вбудовують у вектори, і здійснюють трансформацію. Бактерії висівають на тверде середовище так, що кожна колонія походить від однієї клітини. Отже, набір колоній – це набір різноманітних клонів, кожен з яких містить один із фрагментів геному.

Аналогічно створюють бібліотеки клонів кДНК (комплементарна ДНК-копія молекули мРНК). Для цього спочатку виділяють сумарну мРНК із клітин певного типу. Використовуючи зворотну транскриптазу та оліго(dT), які є комплементарними 3′ -кінцевим polyA-хвостам мРНК, як праймери, на цих мРНК синтезують комплементарні ланцюги ДНК. Видаляють ланцюг РНК РНК-азою і добудовують другий ланцюг ДНК за допомогою фрагмента Кленова ДНК-полімерази І. Далі отримані молекули кДНК піддають клонуванню. На відміну від геномної бібліотеки, бібліотека клонів кДНК містить тільки кодуючі послідовності (екзони) генів і тільки таких, котрі є активними в клітинах даного типу.

Рис. 5. Метод дробовика.

Потрібну нуклеотидну послідовність серед бібліотеки клонів можна знайти за допомогою гібридизації клонованої ДНК із радіоактивно міченим ДНК-зондом (рис. 6). Колонії бактерій у чашці Петрі переносять на нітроцелюлозний фільтр – роблять своєрідну репліку. Здійснюється лізис клітин, депротеїнізація та денатурація ДНК у лужному розчині. Після висушування фільтра одноланцюгова ДНК необоротно фіксується на ньому. Фільтр обробляють радіоактивно міченою ДНК певної послідовності – зондом. Якщо зонд є комплементарним ДНК-клону, відбувається гібридизація – ренатурація дволанцюгової ДНК. Детектування цього факту за допомогою авторадіографії дозволяє ідентифікувати розшукуваний клон.

Рис. 6. Гібридизація клонованої ДНКіз радіоактивним зондом на нітроцелюлозному фільтрі.

Зрозуміло, що описаний скринінг бібліотеки клонів залежить від наявності зонда. Одна з можливостей приготувати зонд базується на відомостях про амінокислотну послідовність білка того гена, клон якого потрібно відшукати (або білка-гомолога іншого організму). Хімічний синтез короткого олігонуклеотиду (~20 нуклеотидів) із послідовністю, що відповідає фрагменту амінокислотної послідовності білка й тому має бути комплементарною ділянці ДНК клону, дозволяє отримати зонд. Після внесення радіоактивної мітки такий олігонуклеотид можна використати для гібридизації. Проте, зважаючи на виродженість генетичного коду, бажано синтезувати набір послідовностей, які відповідають усім можливим комбінаціям кодонів для даної ділянки послідовності амінокислот. Суміш таких альтернативних олігонуклеотидів, один із яких є напевно комплементарним, і використовують як зонд.

Замість синтезу набору олігонуклеотидів можна обійтися синтезом лише одного зонда, використовуючи базу даних EST (Expressed Sequence Tag). База є загальнодоступною колекцією великої кількості коротких (200 – 400 пар основ) фрагментів послідовностей кДНК багатьох організмів. Щоб приготувати зонд, достатньо знайти в EST-базі коротку ділянку, яка відповідає фрагменту послідовності білка, і синтезувати її.