КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Цель занятия: Ознакомиться с современными представлениями о механизме действия ферментов и кинетике ферментативных реакций.

Исходный уровень знаний:

- белковая природа ферментов;

- структура сложных ферментов;

- строение молекулы фермента;

- кинетика химических реакций.

Содержание занятия.

I.2. Современные представления о механизме действия ферментов (гипотеза Фишера, Кошланда).

Полифункциональный катализ.

Кинетика ферментативных реакций. Константа Михаэлиса.

Зависимость активности ферментов от различных факторов.

Определение активности ферментов: принцип, значение в медицине.

II.1. Работа № 1. АКТИВНОСТЬ a - АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

Принцип метода.

Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством (в мл) 0,1% раствора крахмала, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при температуре 38⁰С в течение 30 минут. В норме амилазная активность равна 160 - 320. Амилазная активность обозначается А 38⁰/30'. Этот метод широко используется для определения амилазной активности крови и мочи.

Порядок выполнения работы:

В 10 пробирок налить по 1 мл воды. В 1-ю пробирку добавить 1 мл слюны, разведённой в 10 раз. Содержимое пробирки перемешать несколько раз, втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набрать в пипетку 1,0 мл смеси и перенести её во 2-ю пробирку. Содержимое тоже перемешать и 1,0 мл перенести в 3-ю пробирку и т. д. до 10 пробирки. Из 10-ой пробирки 1,0 мл смеси вылить.

Рис. 3. Разведение слюны

Во все пробирки добавить по 1,0 мл воды и по 2,0 мл 0,1% раствора крахмала, встряхивая, перемешать и поместить в термостат при 38⁰С на 30 минут. После инкубации пробирки охладить водопроводной водой, добавить по 1 капле 0,1% раствора йода и перемешать. Отметить окраску в каждой пробирке и, пользуясь таблицей, сделать расчет.

Расчет: отметить пробирку, где гидролиз крахмала прошел полностью при наименьшем количестве фермента и по количеству неразведённой слюны (А) в данной пробирке рассчитать амилазную активность (Х) следующим образом:

А мл слюны расщепили 2,0 мл 0,1% раствора крахмала.

1 мл слюны расщепил Х мл раствора крахмала.

В 3-й пробирке, например, А =1/80 мл.

ВЫВОД: