Мутации ДНК.

Это изменение в последовательности оснований в ДНК. Мутации могут происходить либо в результате замещения одного основания на другое либо вставки других оснований. Наиболее распространено одной пары оснований на другую.

Ошибки могут быть вызваны изменением структуры оснований, например таутомерным сдвигом от кето- к енольной форме в момент спаривания. Измененное основание может присутствовать в матрице ДНК либо в поступающем для синтеза дезоксирибонуклиотиде.

Например, вследствие редкой лактимной форме Тимина давать пару не с аденином, а гуанином.

Денатурация ДНК.

Молекула представляет собой спираль. При определенных условиях (нагревании, действии агрессивных сред) происходит денатурация – расплетание двойной спирали, разрываются водородные связи. Происходит плавление ДНК, изменяется плотность раствора и свойства растворов. Процесс сплетания происходит очень медленно, но как только на каком-то фрагменте будет найдено соответствие, то восстановление структуры происходит очень быстро.

Процесс транскрипции – это расплетание молекулы ДНК в размерах определенного гена и снятие информации с цепочки при синтезе матричной (информационной) РНК. По принципу комплементарнойсти подходят азотистые основание за счет образования водородных связей. Фермент полимилаза сшивает эти нуклеотиды и получается информационная РНК. Информация в ней также, что и в цепочке ДНК, транскрипция гена с определенного участка ДНК, дальше в рибосомы.

По принципу комплементарности на каждой из материнских цепей строятся дочерние молекулы ДНК, новая цепь, которая содержит материнскую ДНК при делении клетки

В клетке человека в 600 раз больше ДНК, чем в бактерии кишечной палочки. Общая физическая длина человеческой ДНК составляет 2*10^(10) км. Вся ДНК больше, чем расстояние от земли до солнца. Вся информация находится в гена. Большая часть ДНК непонятно, что собой представляет.

Секвенирование – определение нуклеотидных последовательностей. К концу XX века полностью секвенированы геномы почти 50 видов живых организмов. Определены нуклеотидные последовательности во всех транспортных РНК. Полная нуклеотидная последовательность ДНК была определена в 1977 году для мелкого бактериофага ФX174 (баткриальный вирус) Сенджером. Это открытие знаменовало собой начало новой эры в биохимической генетике. Размер ДНК этого бактериофага 5386 аминокислотных остатков. ДНК фага содержит 9 генов, имеются перекрывающиеся гены и гены внутри генов.

В настоящее время можно определить последовательность нуклеотидов в любой ДНК. Для этого есть соответствующие методы, компьютерные программы. Роботы и особый изощренный математический аппарат.

Успехи были достигнуты в результате трех открытий:

1. Выделение особых рестриктирующих эндонуклеаз, т.е. ферменты, расщепляющие полинуклеотидные цепи в определенном месте, например между A и T, между пуриновым и перимидиновым основанием. Разная нуклеаза расщепляет в определенном месте, известно более 150 таких эндонуклеаз. Имея только две эндонуклеазы моно расщепить разными способами с образованием перекрывающихся последовательностей.

2. Усовершенствование электрофоретических методов разделения фрагментов ДНК в соответствии с числом содержащихся в них нуклеотидных остатков. Эти методы обладают настолько высоким разрешением, что позволяют разделить ДНК размером 200 нуклеотидов. Электрофоретическое разделение производят на пластинке полиакриламидного геля (РИС 5).

полиакриламид

Чем короче олигонуклеотид, тем быстрее он движется к положительному электроду, изменяя плотность полиакриламидного геля данную процедуру можно использовать для разделения длинных олигонуклеотидов.

3. Разработка методов клонирования ДНК. Эти методы сделали возможным получение достаточно больших количеств чистых генов, т.е. исходного материала для секвенирования. В настоящее время существует два метода (биологический (Сенджера) и химический (Максама-Гилберта)).

Принцип метода Максама-Гилберта.

Олигонуклеотид состоит из 10 нуклеотидов.

Г-А-Т-Ц-А-Г-Ц-Т-А-Г.

Вводим радиоактивную метку на 5’ конец (P³²):

Ф-Г-А-Т-Ц-А-Г-Ц-Т-А-Г.

Меченый олигонуклеотид разделяют на 4 порции: первую порцию подвергают химической обработке, в результате которой олигополинуклеотид распадается на небольшие куски со статистическим выщепленеим по С, при таком расщеплении можно получитьследующую цепь:

ФГ, АГЦ, АГЦ, ТАГ;

ГАГ ЦАГ, ГАГ, АГ.

Вторую порцию исходного плинуклеотида подвергают другой химической обработке, в результате которой расщепляються только остатки по гуанидину.

ГАТЦА, ГАТЦАГЦТА.

Третья порция – статистическое выщепление по А:

ГАТЦ, ГАТЦАГЦТ Г

Высщепление по Т

Имеем четыре различных смеси меченых фрагментом. Каждую из четырех этих смесей подвергают электрофорезу на пластинке геля. Обеспечивающей четкое разделение по количеству нуклеотидов в фрагменте независимо от качества.