Определение нуклеотидных последовательностей в геномах.

Первым разработанным методом определения нуклеотидных последовательностей в генах, составляющих геном был метод «клон за клоном». На первом этапе создаются геномные (хромосомные) библиотеки фрагментов, которые покрывают всю геномную ДНК организма (геномные клоны). Извлеченные из библиотек клоны анализируют, чтобы создать генетические и физические карты на основе наследования генетических маркеров (RFLPs, STSs) в гетерозиготных семьях. После этого в клонах ищут перекрывающиеся друг с другом последовательности. Таким образом, перекрывают всю хромосому. На последнем этапе определяют нуклеотидную последовательность каждого клона, и, связывая их вместе, составляют последовательность ДНК всей хромосомы (генома). Основные этапы определения нуклеотидных последовательностей генома методом «клон за клоном» представлены на рис. 33.

При использовании второго метода, названного методом дробовика или «шот-ган» (shotgun) клоны из геномных библиотек отбираются случайным образом. В отобранных клонах проводят определение последовательности нуклеотидов на основе секвенирования ДНК фрагментов с обоих концов. Аналогичным образом поступают до тех пор, пока все клоны библиотеки не будут проанализированы. Специально разработанные компьютерные программы позволяют проанализировать перекрывающиеся ДНК-последовательности клонов и связать их вместе. Таким образом, удается получить информацию о последовательности генома (хромосомы) в целом. Этот метод, разработанный К. Вентором в Институте исследования генома, был использован для определения последовательности генома Haemophilus influenzae в 1995 г. После усовершенствования метода Вентор организовал компанию Celera, чтобы определять последовательности геномов эукариот, включая человека.

Следует подчеркнуть, что для исключения ошибок в нуклеотидной последовательности, составляющей геном, работы по секвенированию ДНК проводятся многократно. Так применяя метод дробовика при исследовании генома бактерии Pseudomonas aeriginoza (6,3х10⁶ н.п.) ученые определяли последовательность нуклеотидов 7 раз. Но даже после этого в результате компьютерной обработки данных было выявлено 1604 участка ДНК, для которых были нужны дополнительные исследования. На заключительном этапе полученные методом «шот-ган» данные по двум участкам генома длиной 82 тыс. н.п. сравнили с данными, полученными стандартным методом и результаты полностью совпали.

В частном проекте компании Celera Genomics для определения последовательности ДНК человека (3,2 х10⁹ н.п.), используя метод дробовика, последовательность генома была перекрыта 35 раз. И хотя в черновом варианте расшифровка генома человека завершена, необходимо еще провести коррекцию ошибок, заполнение пробелов размером 150 Mb, а также расшифровку 15% генома гетерохроматиновых районов.