Ионный состав

Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды длякультивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли собоймодификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержанияжизни клеток – Na⁺, К⁺, Са²⁺, Mg²⁺, и , растворенные вбикарбонатном буфере (НCO₃). Также добавлялись антибиотики дляпредотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина илисыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка используется бычий иличеловеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческаясыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческаятрубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Болеесложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и былиразработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивированияэмбрионов различных видов млекопитающих.Энергетическими субстратами для ооцитов и эмбрионов млекопитающих вкультуральной среде обычно служат пируват, лактат и глюкоза, причемусвоение глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии несколькихклеточных делений, а до этого предпочтительным источником энергии служитпируват.Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется ихприсутствием в жидкости яйцеводов многих видов млекопитающих. Было показано,что добавление глутамина в культуральную среду оказывает положительноевлияние на развитие эмбрионов многих видов млекопитающих. Однако привведении в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаютсястабильны в условиях культивирования – при температуре 37С многие из нихразрушаются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладаеттоксическим эффектом.Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработанасреда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержитаминокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – дажежирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в различныхлабораториях. При том, что роль многих компонентов сложных сред до сих порне была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты. CO₂-ИНКУБАТОР Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO₃ в воздухе при температуре 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условиясоблюдаются при использовании CO₃-инкубаторов, поддерживающихнеобходимую температуру, влажность и уровень CO₂ в камере.Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа избаллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды.Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицинскимстандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь, содержащая углекислый газ, азот и кислород в нужной пропорции. Влажность в камере CO₃-инкубаторов поддерживается постояннымиспарением воды со дна камеры либо из специального лотка. Также в некоторыхсовременных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух,позволяющая автоматически поддерживать влажность в камере до 90%.В связи с высоким уровнем влажности в инкубаторах высок риск роста бактерийи плесени, поэтому необходима регулярная очистка всех поверхностей камеры.Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать этонадо с большой осторожностью, поскольку известно негативное влияниеэтилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе сфолликулярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulusoophorus (яйценосный бугорок) представляет собой часть фолликулярногоэпителия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессефолликулогенеза. Помимо прочего фолликулярная жидкость содержит фибриноген,что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколько минут послеаспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложнообнаружить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используютсядва основных подхода:1. Фолликулярную жидкость просматривают под микроскопом сразу послеаспирации и найденные ооциты незамедлительно помещают в среду для отмывки.2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду сгепарином, предотвращающую образование кровяных сгустков.Как правило, в большинстве лабораторий руководствуются вторым подходом. Приэтом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 млдобавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрациюгепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин неоказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона.Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательноотмывают в специальной среде.После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает вэмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается наприсутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирокпереливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопомили инвертированным микроскопом при небольшом увеличении. Как правило,комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистыекомки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см.Найденные ооциты помещаются в среду для отмывки, содержащую HEPES-буфер,позволяющий манипулировать с ооцитами на воздухе без риска изменения рН вщелочную сторону (такие среды производятся большинством фирм,специализирующихся на производстве сред для ЭКО), затем отмываются вкультуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальнуючашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооцитов икультивирование эмбрионов.Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды,покрытых слоем минерального масла, предварительно эквилиброванного скультуральной средой в присутствии 5% С0₂. Преимуществамикультивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральнуюсреду микроорганизмов и частичек пыли, возможность культивирования внебольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшойконцентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испарения воды ивыхода CO₂ из среды вне инкубатора. Однако, если капли со средойпод маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходномуравновесию влажности и концентрации CO₂ займет гораздо большевремени, чем в отсутствие масла.Манипуляции с ооцитами проводят с помощью оттянутых стерильных пастеровскихпипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклянных(пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют идругие способы манипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зависит отопыта и желания эмбриолога.Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценитьколичество, качество и степень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus. Классификация комплексов ооцит-cumulus, применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж

	Ооцит	Характеристика
	Очень незрелый	Клетки cumulus и corona radiata плотно упакованы вокруг ооцита. Иногда можно увидеть ядро ооцита - зародышевый пузырек. Такой ооцит находится на стадии профазы первого деления мейоза (GV-germinal vesicle stage), на которой происходит блок мейоза в процессе оогенеза. Полярное тельце еще не сформировалось
	Незрелый	Клетки corona radiata все еще плотно примыкают к ооциту, cumulus незначительно увеличился. Такой ооцит обычно находится на стадии метафазы первого деления мейоза (М I), блок мейоза уже снят, однако формирование полярного тельца пока не произошло
	Преовуляторный	Клетки corona radiala расходятся лучами от ооцита, cumulus разросшийся, но имеет клеточную структуру. Ооцит находится на стадии метафазы второго деления мейоза (М II), Полярное тельце уже сформировано
	Перезрелый	Присутствует небольшое количество клеток corona radiata, уже не примыкающих плотно к ооциту, который хорошо просматривается. Cumulus разросшийся, но все еще имеет клеточную структуру. Полярное тельце обычно хорошо видно
	Лютеинизированный	Вокруг ооцита клетки cumulus образуют скопления (комки), остальной cumulus представляет собой желеобразную массу с небольшим количеством клеток
	Дегенеративный	Несколько клеток гранупезы окружают ооцит, cumulus отсутствует или очень маленький. Ооцит обычно темноокрашен

Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцит-cumulus, какправило, субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита.Асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus достаточночасто встречается в циклах стимуляции суперовуляции при ЭКО. Однако болееточное определение степени зрелости (если клетки corona radiata и cumulusудаляют ферментативно или механически) может привести к травматизации ооцитаи увеличению риска полиспермии при оплодотворении.На рис.2 представлены данные по распределению ооцитов, полученных в ходестимуляции суперовуляции, по степени зрелости. Оценка производилась послеудаления клеток cumulus.

Рис.2. Распределение ооцитов по степени зрелости ядра на момент ТВП: GV – стадия зародышевого пузырька (germinal vesic le) – очень незрелый ооцит; М I – стадия метафазы первого деления мейоза – незрелый ооцит; М II –стадия метафазы второго деления мейоза – зрелый ооцит; ATR –дегенеративный ооцит (См. рис. 3)

Рис.3. Ооцитарно-фолликулярные комплексы.а – незрелый; б – зрелый; в – перезревающий. Микрофотографии живых объектовв фазовом контрасте. ОБРАБОТКА СПЕРМЫ ПЕРЕД ОПЛОДОТВОРЕНИЕМ ООЦИТОВ in vitro Эякулят для ЭКО получают путем мастурбации в стерильный контейнер. Послеполного разжижения спермы, происходящего при комнатной температуре через 30 -60 мин, приступают к ее обработке. Предварительно необходимо провести анализконцентрации сперматозоидов, их подвижности и морфологических характеристикпо стандартной методике ВОЗ.Перед тем как добавлять сперму в культуральную среду с ооцитами, необходимоее обработать в целях удаления семенной плазмы и получения максимальнополноценной фракции прогрессивно подвижных сперматозоидов. На практикеприменяются два основных метода обработки спермы - центрифугирование-флотация (процедура swim-up) и градиентное центрифугирование.При использовании методики swim-up 1 – 2 мл спермы помещают в коническую 10 –15-миллиметровую пробирку, добавляют 5 - 10 мл среды для отмывки* и центрифугируют 5 – 10 мин при ускорении 1200 g. Затем супернатантудаляют, осадок ресуспендируют в 2 – 3 мл среды и вновь центрифугируют. Послеудаления супернатанта 1 – 2 мл свежей среды осторожно наслаивают на осадок,пробирку помещают в CO₂-инкубатор при 37°С на 30 – 60 мин. В течениеэтого времени подвижные сперматозоиды должны мигрировать в наслоенную среду,оставив на дне пробирки неподвижные сперматозоиды, дебрис и иные клетки. Еслипробирки будут установлены наклонно, увеличится площадь контакта осадка сосредой и, соответственно, выход подвижных сперматозоидов. Для определенияконцентрации и подвижности сперматозоидов в надосадочной жидкости беретсяаликвота 10 или 50 мкл. Затем необходимое количество чистого супернатанта используется для инсеминации. Важным шагом вперед в методике обработки спермы стало внедрение методацентрифугирования в градиенте Перколла. Перколл представляет собой суспензиюсиликоновых гранул 15 – 30 нм в диаметре, покрытых слоем поливинилпирролидона(PVP), поскольку в чистом виде они токсичны для клеток. Особенностью Перколлаявляется очень низкая осмолярность – 25 мОсм/л, поэтому при разведении всреде до различных концентраций, соответствующих различным плотностям (от1,01 до 1,13 г/л), осмолярность растворов остается постоянной. РастворыПерколла (40 и 90%) готовятся из 100% раствора, представляющего собой смесь 9частей Перколла и 1 части 10-кратно концентрированной среды для отмывки.Прерывистый градиент плотности достигается путем помещения 1,5 мл 40%-гоПерколла на 1,5 мл 90%-го в конической пробирке; сверху аккуратнонаслаивается сперма (1 – 2 мл), и вся эта трехслойная колонкацентрифугируется 15 мин при ускорении 700 g. После центрифугирования в осадокпопадают только функционально нормальные сперматозоиды; неподвижные ианомальные сперматозоиды, а также лейкоциты и другие клетки спермызадерживаются на границе 40 и 90%-q фракций. Осадок отбирается пастеровскойпипеткой и два раза отмывается в специальной среде, как и в случаеприменения методики swim-up (см. выше).Последний метод, по мнению многих авторов, является более предпочтительным,сочетая в себе хорошую сепарацию и высокий выход фертильных сперматозоидов.Кроме того, описано и защитное действие Перколла: он не позволяет попасть восадок дефектным сперматозоидам, лейкоцитам и другим клеткам спермы,производящим большое количество свободных радикалов, способных повреждатьмембраны сперматозоидов. Таким образом, чем более благоприятно соотношениежизнеспособных сперматозоидов и дефектных, тем меньше вероятностьповреждений первых. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ООЦИТОВ in vitro Много споров и разночтений вызывает вопрос о времени введения сперматозоидовв среду, где культивируются ооциты. Наиболее общепринятым считается, чтомежду выделением первого полярного тельца ооцита (достижением стадии М II) идобавлением спермы должно пройти около 4 ч, тогда способность такого ооцита коплодотворению и последующему дроблению будет максимальной.Преовуляторный фолликул на момент аспирации (обычно 36 ч после введенияхорионического гонадотропина - ХГ, имитирующего пик эндогенного ЛГ в моментовуляции при естественном цикле), как правило, содержит ооцит на стадии МII. В естественных условиях овуляция, а значит, и возможность оплодотворениянаступает через 38 - 40 ч после пика ЛГ.На практике преинкубация ооцитов перед инсеминацией составляет от 2 до 6 ч.Данные по влиянию времени инкубации на оплодотворяемость ооцитов, дроблениеэмбрионов и беременность разноречивы. По данным К. Yanagida с соавт.,исследовавших такую зависимость при инкубации ооцитов в течение 1 - 11 чперед оплодотворением (применялся метод интрацитоплазматическоймикроинъекции сперматозоида в яйцеклетку - ИКСИ), способность ооцитов коплодотворению, последующему дроблению и имплантации статистическидостоверно снижается при инкубации их более 9 ч. Достоверных различий приинкубации в течение 1 - 9 ч не было обнаружено. В другом исследовании былопоказано, что инкубация более 9 ч перед оплодотворением наиболее оптимальнадля последующего прохождения всех вышеуказанных процессов при ИКСИ;исследователи предполагают, что это связано с дозреванием цитоплазмы ооцита,необходимым для его активации при оплодотворении.Важным моментом в обеих работах является то, что инкубация ооцитовпроисходила в присутствии клеток cumulus и corona radiata. Известно, чтосозревание ооцита полностью зависит от окружающих клеток фолликулярногоэпителия, поставляющих в ооплазму РНК и белки, необходимые для развитиябудущего организма до включения его собственного генома, а также белковыефакторы, отвечающие за процесс оплодотворения. Было показано, что дозреваниеооцитов in Ditro со стадии GV до стадии МII при интактном cumulusпроисходило с большей вероятностью, причем последующее их оплодотворение идробление было лучше.Несмотря на расхождение данных, большинство авторов считает, чтопреинкубация обязательно необходима, а ее оптимальная длительностьподбирается эмпирически в каждой лаборатории. При этом окно оплодотворениядля зрелого ооцита достаточно широко, однако преждевременное оплодотворениенедозревших ооцитов может негативно повлиять на исход дробления и имплантацииэмбрионов.Помимо фактора времени, в инсеминации важным является и количественныйфактор. Количество прогрессивно подвижных сперматозоидов обычно должносоставлять 50 - 100 тыс. на 1 мл среды (при культивировании в относительнобольшом объеме среды) либо на ооцит (при культивировании в микрокаплях подминеральным маслом). Подбирая концентрацию сперматозоидов приоплодотворении ооцитов in vitro, нужно иметь в виду, что при добавлениименее 50 тыс. активно подвижных сперматозоидов на 1 мл частота оплодотворениябудет существенно снижена, а при использовании очень высоких концентрацийвозникают побочные эффекты: полиспермия (проникновение более одногосперматозоида в ооцит при оплодотворении), снижение жизнеспособностиполученных эмбрионов (за счет повреждения кислородными радикалами, припопадании погибающих или мертвых сперматозоидов, либо воздействияизбыточного количества литических акросомальных ферментов).Однако это правило реализуется лишь в случае нормальной морфологиисперматозоидов, при наличии необходимой концентрации активно подвижныхсперматозоидов в эякуляте, отсутствии дефектов акросомальной реакции илиотсутствии больших концентраций антиспермальных антител в сперме (MAR-тестменее 50%). При наличии этих и других отрицательных факторов, а также принеудаче оплодотворения в предыдущей попытке ЭКО концентрация сперматозоидовможет быть повышена путем снижения объема среды культивирования(культивирование в микрокаплях, соломках для криоконсервации,микрокапиллярах), однако это далеко не всегда приводит к желаемымрезультатам. Для облегчения проникновения сперматозоида в ооцит клеткиcumulus и corona radiata могут быть удалены ферментативно и механически,однако это повышает риск полиспермии.

123

Дата добавления: 2015-08-08; просмотров: 638;