Лекция 8. Молекулярно-генетические и клеточные механизмы регенерации

Конец ХХ века ознаменовался рядом крупнейших достижений в молекулярных и клеточных биотехнологиях, открывших широкие перспективы для создания принципиально новых и эффективных биомедицинских технологий. Одним из таких событий стали стволовые клетки (СК).

Основателем науки о СК считается профессор императорской ВМА Максимов. Он объяснил процессы обновления клеток крови наличием особых клеток, которые он назвал СК. Фундаментальные основы науки о СК костного мозга заложил Фриденштейн (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамолеи РАМН), Чертков.

Первые попытки применить СК для лечения больных были проведены на Западе и в США.

1980 г. Томас произвел первую трансплантацию костного мозга больному лимфомой (Нобелевская премия в области медицины)

1992 г. Дэвид Харрис впервые провел забор и сохранение пуповинной крови сына.

2001 г. в США осуществлена удачная пересадка нейтральных СК человеку после инсульта. Пересадка аутологичных скелетных миобластов больному с инфарктом миокарда.

2007 г. группе ученых (Марио Капекки, Оливер Смитис и сэр Мартин Эванс, метод «нокаута») присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины «За открытие принципов внедрения специфических модификаций в организм мышей с использованием эмбриональных СК»

В основе метода нокаута генов лежит явление гомологической рекомбинации обмена участками между парами гомологичных хромосом.

Ученые получили искусственно синтезированный фрагмент ДНК, который перенесен ретровирусом в клетку (т.к. у них нет своей ДНК). Синтез-я ДНК за счет рекомбинации встраивалась в определенную хромосому и в последствии ученые не только выключали некоторые гены in vitro, но и получили потомство мышей, нокаутных по определенному гену.

БСК мышей некоторой чистой ген. однородной линии был введен фрагмент мутантной ДНК. В конечном счете получили потомство, в котором 50% не имели мутантных генов.

Метод «нокаута» генов позволяет исследовать роль каждого гена в развитии рганизма и его роль в развитии патологии.

СК — популяции незрелых клеток, обладающие неограниченной репликацией и способные дифференцироваться в различные типы клеток. СК – основа, из которой развивается весь организм. Зародыш целиком состоит из СК, которые постепенно начинают дифференцироваться в клетки будущих органов и тканей. Во взрослом организме СК значительно меньше, чем у новорожденного и они выполняют регенеративную ф-ю.

СК характеризуются свойствами:

-способностью к неограниченному делению

-детерминации, незавершенностью дифференцировки

Особенности митоза: из каждой СК при митозе образуются 2 дочерние клетки, одна из которых полная копия материнской и способна к самообновлению, вторая изначально детерминирована и обладает потенцией к дифференцировке. СК порождающие только 1 вид дифференцированных клеток называются унипотентными. 2 – дипотентными. Те, которые дают начало нескольким видам разных специальных клеток в пределах 1 типа (н-р клетки крови), называются плюрипотентными/полипотентными. СК, которые обладают неограниченным потенциалом дифференцировки и способны реализовывать генетическую информацию ядер клеток, обеспечивая их дифференцировку а так же развитие до целого организма – тотипотентными.

Выделяют 4 основных типа СК:

*эмбриональные ЭСК

*фетальные

*соматические

*мезенхимные

ЭСК обнаруживаются на самой ранней стадии развития зародыша. С открытием СК ученые пытались выделить прародительницу мультиполярной СК, способной превращаться в клетку нескольких типов (Свойство мультипотентности).

1981 г. М. Эванс выделил такую клетку (из зародыша мыши)

1908 г. Томпсон и Беккер выделили такую клетку из бластоцисты человека.

Источником ЭСК послужили зародыши, оставшиеся неиспользованными для создания беременности после процедуры суперовуляции при ЭКО. Клетки эмбриобласта собирают и метят антителами. Эмбриобласт превращает суспензию клеток с помощью ферментов и выращивают в питательной среде. ЭСК растут клонами, из которых удается выделить несколько линий ДНК человека: ХХ и ХY. Эти клоны сохраняют высокий темп клеточных делений, высокую активность теломеразы (фермент, отвечающий за синтез теломеры), минимальный белковый фенотип и потентность генома в дифференцировке в разные соматические клетки.

Сейчас в распоряжении ученых в лабораториях хранятся до 10 бессмертных саморазмножающихся клеточных линий человеческой ЭСК.

Характеристика СК:

-возникают в эмбриогенезе

-повторяют ранний эмбриогенез

-неорганизованный рост клонами клеток без фенотипа

-дифференцировка соматических клеток in vitro встраиваются в ткани и дифференцируются in situm (геномная гибридизация)

Одним из известных ученых, занимающихся в РФ СК является профессор В. Репин. По мнению репина, самое главное в свойствах ЭСК состоит в том, что ген. информация заключенная в ядре находится на нулевой точке отсчета.

Дело в том, что все соматические клетки человека специализированные. Они выполняют определенные ф-и. Клетки крови отвечают за иммунитет, переносят О2.

Клетки костной ткани формируют скелет.

У ЭСК еще не включены механизмы, определяющие ее специализацию.

В нулевой точке ее геном не запустил ни одной программы и не начал выполнять программу размножения. Таких клеток сотые доли %, поэтому исследованием их получить трудно. ЭСК не работают в автоматическом режиме, как клетки крови. Могут принять любую программу и превратиться в 1 из 150 типов зародышевых клеток.

ЭСК ждет особенного сигнала, чтобы начать превращение → не имеет никаких ф-й, кроме переноса мРНК в следующее клеточное деление.

Из ЭСК формируются островки в различных органах и тканях. По сути наши органы являются смесью взрослых специализированных клеток с вкраплениями зародышевых тканей в виде ЭСК. Эти клетки растут, размножаются и умирают. Лишь клетка родоначальник бессмертна.

Сейчас ученые научились выделять из головного мозга зародышей не отдельные ЭСК, а зародышевые ткани, из которых формируются все остальные ткани.

При хранении зародыша при t’ +4 С, через 4-5 часов все клетки погибают, остаются лишь ЭСК. Открытие Томпсона и Беккера можно сравнить с открытием Уотсона и Крика. Оно является 3 по значимости мировым открытием в молекулярной биологии.

2001 г. ученые расшифровали молекулярную структуру ДНК, как работают составляющие гены — поможет изучить зародышевые СК.

Зародышевые ЭСК являются прекрасной моделью для того, чтобы понять, как 5000 генов эмбриогенеза тиражируют ген. информацию, чтобы из 1 клетки вырос человеческий организм, состоящий из клеток.

Вся работа генома контролируется определенным набором генов, который формирует костяк клеток, внутреннюю структуру — органоиды и целиком клетки с полным набором генов, т.е. клетка в последний момент получает «инструкцию», согласно которой будет определено место в организме и ф-я. Перед 1 клеткой стоит задача превратиться в организм, состоящий из млрд. клеток. Для этого у нее есть 5000 генов эмбриогенеза, регулирующих этот процесс развития зародыша.

Оплодотворение яйцеклетки – зигота начинает делиться через 30 часов после оплодотворения. До 3-4 суток эмбрион – полноценный слайд из 12 клеток.

Еще через 5 дней ЭСК формируют клеточную сферу — бластоцисту, диаметром 150 микрон.

С начала оплодотворения яйцеклетка размножается, превращаясь в клетку, задача которой не превратиться в зачатки органов и тканей, а переносить ген. информацию в виде молекул ДНК.

При накоплении значительной информации, в работу вступают гены, ответственные за специализацию. Появляются семейства СК – предшественников органов и тканей. Количество делений таких клеток запрограмированно, поэтому ученым важно выделить ЭСК на стадии, пока не произошла дифференцировка.

Фетальные СК — СК, из которых развиваются различные органы зародыша. Изучено 3 разновидности:

-нейтральные

-гемопоэтические (предшественники клеток крови)

-клетки, предшественники поджелудочной железы

Нейтральные СК — способны трансформироваться в клетки головного мозга.

Соматические СК — способны превращаться в клетки определенных типов, образовывать ткани взрослого организма. Источниками у взрослых является костный мозг, периферическая кровь, жировая ткань, скелетная мускулатура, пульпа зуба, печень, кожа, поджелудочная. Клетки данного типа поддерживают обновление тканей на протяжении всей жизни.

Клетки костного мозга взрослого человека содержат СК:

*гемопоэтические

*стромальные (очень мало, представляют собой сложные, долгоживущие системы, редко обновляющиеся. Как СКК постоянно циркулируют в кровотоке млекопитающих)

СК участвуют в восстановлении поврежденных тканей 2 вида:

-специализированные тканевые

-универсальные стромальные клетки костного мозга

Тканевые используются для восстановления поврежденного участка в данном месте для определенного вида тканей.

Стромальные СК костного мозга универсальны.

Мезенхимные СК присутствуют во взрослом костном мозге могут пролиферировать (расти), имеют фибробластоподобные фенотипические образования. _____________ дифференцируются в тканях мезенхимального происхождения кость, хрящ, жир, сухожилия, строма

Получение СК

СК получают из костного мозга, жира, мышечной ткани, кожи.

Однояйцевые близнецы — доноры (друг для друга). Если нет идентичного донора среди родственников, можно использовать HLA гистосовместимого донора.

В Европе и США регистры HLA доноры. Доноры могут добровольно пожертвовать костным мозгом. Появляется возможность выделять ЭСК из бластоцисты и культивировать ее в лабораторных условиях.