Лекція 15. Синдром надбаного імунодефіциту (СНІД).

На початку 80-х років було ідентифіковано хворобу, яку кваліфікували як гострий вторинний імунодефіцит. Вона характеризувалася зниженням всіх імунних функцій, і людина гинула від звичайної інфекції, найчастіше пневмонії. Паралельно, досить часто знаходили ураження нервової системи і злоякісне захворювання — саркому Капоші.

Було винайдено групу ризику цього захворювання — наркомани та гомосексуалісти. Потім було знайдено, що СНІД є ендемічною хворобою у деяких країнах Африки (Заїр, Уганда), де до 90% населення інфіковано.

Досить довго дискутувався шлях появи цієї інфекції в країнах Америки і Європи (обговорювалось навіть штучне створення цього вірусу як бактеріологічної зброї). Найбільш очевидним є занесення її із країн Африки мігрантами, які поповнювали ряди наркоманів і гомосексуалістів.

Коли коло інфікованих поширилося, виявилося, що вірус може передаватися і нормальним статевим шляхом, а також через кров, наприклад, при трансплантаціях і хірургічних втручаннях.

Природу збудника, що викликає СНІД, було з’ясовано досить швидко. В лабораторіях Р.Галло (США) і Л.Монтань’є (Франція), майже одночасно, було показано, що збудником є РНК-овий ретровірус, споріднений до вже відомих інших вірусів імунодефіциту. Його назвали вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ). Подібно до інших ретровірусів, потрапивши у клітину, він за допомогою зворотної транскриптази перетворює свою РНК на кДНК, яка і вбудовується в геном інфікованої клітини. Транскрипція цієї ДНК призводить до утворення нових вірусних часток, які відшнуровуються від поверхні інфікованої клітини і заражають нові мішені. Було показано, що вірус інфікує CD4⁺ T клітини (тобто Тх) і таким чином вражає загальний стан імунітету. Досить швидко було ідентифіковано поверхневий білок вірусу, gp120, відповідальний за зв’язування із Т клітинами. Після відкриття природи вірусу з’явилася надія швидкого подолання хвороби шляхом (1) анти-ретровірусної терапії і (2) створення вакцини. Однак пройшло майже 20 років, а про перемогу над СНІДом говорити рано, хоча над цим працювали і працюють кращі лабораторії світу. За цей час було вивчено досить багато про сам вірус і ці знання роблять зрозумілим, чому так важко подолати цю інфекцію і запобігти їй шляхом вакцинування.

Виявилося, що хвороба має дуже довгий асимптоматичний період: від зараження до появи симптомів проходять місяці, а то і роки. Спочатку вважали, що вірус у цей час знаходиться в латентному стані, а потім якимось чином активізується. Проте було з’ясовано, що імунна відповідь на вірус проявляється дуже швидко: вже через 10-12 днів після зараження у крові інфікованих знаходили антитіла до ВІЛ. На цій основі було розроблено імунодіагностикуми, за допомогою яких стали тестувати як людей, так і донорську кров, призначену для трансплантації. Можливість діагностики захворювання мала велике значення для припинення (уповільнення) поширення інфекції (вибракування заражених порцій крові). Разом із розповсюдженням інформації про шляхи передачі інфекції, цими мірами вдалося знизити швидкість збільшення захворювань у США. На жаль, воно продовжувало і продовжує збільшуватися в країнах Африки, Південно-Східної Азії та Східної Європи. Головними шляхами інфекції стали статеві контакти і використання нестерильних інструментів (в тому числі шприців). На сьогодні у світі є більше 30 млн. інфікованих, 90% яких живе у країнах третього світу. В 1997 році близько 600 тис. дітей отримали ВІЛ від своїх матерів при народженні. Головним засобом лікування є анти-ретровірусна терапія. Однак можливості її обмежені, завдяки особливостям метаболізму вірусу в організмі (дивись нижче). Крім того, анти-вірусні препарати є досить дорогими і доступні не кожному. Перш за все, вони не доступні для хворих із країн, що розвиваються, саме там, де рівень інфікованості населення найвищий.

Як вірус потрапляє в клітину.

ВІЛ потрапляє в клітину за допомогою свого білка оболонки — envelope protein. Він синтезується у вигляді попередника gp160, який гликозилюється в клітинах-мішенях і розщеплюється клітинною конвертазою на 2 субодиниці: gp120 - поверхнева і gp41 - трансмембранна. Субодиниці залишаються нековалентно зв’язаними і олігомеризуються в тримери на поверхні віріону. Зв’язування з клітиною виконує gp120; при цьому gp41 набуває конформаційних змін і опосередкує злиття вірусу з клітиною. gp41 має на своєму N-кінці так званий “фузогенний пептид”, гідрофобний, багатий на гліцини. Далі за ним слідують два гідрофобних повтори, які характерні для білків з суперспіральною будовою. При зв’язуванні gp120 із поверхнею клітини фузогенні пептиди, до тих пір сховані в середині молекули, виходять назовні і втикаються в мембрану клітини-мішені. Ця проміжна структура далі трансформується так, що мембрану, як шпилька для волосся, протикають 6 спіралей тримеру. Вони утворюють пору, через яку і відбувається злиття мембран вірусу і клітини. Цей механізм нагадує такий у вірусів грипу і мишачої лейкемії.

В середині 80-х років було встановлено, що ВІЛ взаємодіє з CD4 на поверхні Тх клітин. Пізніше з’ясували, що CD4 експресований не тільки на Тх, а і на моноцитах, макрофагах і дендритних клітинах.

При подальшому вивченні було знайдено, що є два штами вірусу, які розрізняються за тропізмом до різних клітин: перший інфікував активовані і трансформовані Т-клітини, а другий — макрофаги і Тх у спокої. Різниця цих двох штамів полягала в послідовності V₃ домена білка gp120.

Із цих досліджень стало ясним, що вірус впізнає на поверхні клітин, які він інфікує, не тільки CD4, а і щось інше. І такі молекули було ідентифіковано. Ними виявилися рецептори до хемокінів:

CXCR4 — експресований на активованих і трансформованих Т-лімфоцитах,

CCR5 — експресований на макрофагах і наївних Т-лімфоцитах.

Відповідно, штами вірусу за тропізмом до цих клітин назвали Х4 і R5. Є віруси з подвійним тропізмом, R5Х4.

Білок gp120 прямо взаємодіє з рецепторами CXCR4 і CCR5. Зв’язування з CD4 індукує конформаційні зміни в gp120 і збільшує його афінність до хемокінових рецепторів.

Таким чином, хемокіновий рецептор — це головний рецептор, що зв’язує білок оболонки вірусу з клітиною. CD4 потрібний для того, щоб сконцентрувати вірус на поверхні клітини і полегшити взаємодію із хемокіновим рецептором, тобто він фактично є корецептором для хемокінового рецептору.

Рецептори СХСR4 і ССR5 — це білки, що сім разів перетинають мембрану (серпентинові рецептори), зв’язані з G-білком. Зараз відкрито, що рецепторами для вірусів імунодефіциту мавп і людини можуть бути декілька хемокінових рецепторів: 5 головних і 4 мінорних. Вони експресовані, крім Т-клітин і моноцитів, на еозінофілах, клітинах мікроглії, прямої кишки і плаценти. Потрапляння вірусу до клітини опосередковане діяльністю G-білків, і сигнал, що передається, нагадує сигнал хемокінів (збільшення концентрації Са²⁺, участь тирозинових кіназ). Хемокіни, які в нормі зв’язуються з цими рецепторами, запобігають зв’язуванню вірусу (конкурують з ним). Цікаво, що при зараженні на ранніх стадіях захворювання атаку починає R5 вірус, а вірусні штами з Х4 або R5Х4 тропізмом з’являються пізніше — тропізм вірусу розширюється.

Гомозиготна делеція в гені ССR5, яка зустрічається у 1% кавказців, робить їх нечутливими до ВІЛ.

Експресія рецепторів до хемокінів, чутливих до ВІЛ, на клітинах мікроглії пояснює частоту неврологічних захворювань, що супроводжують СНІД, а експресія їх у прямій кишці дає змогу зрозуміти шлях зараження гомосексуалістів.

Допоміжні білки.

Для реплікації в інфікованій клітині ВІЛ використовує допоміжні білки. Крім продуктів генів gag, pol і env, які використовують інші відомі ретровіруси, ВІЛ експресує гени додаткових малих білків: tat, rev, nef, vif, vpr, vpu . Кожен із продуктів цих генів виконує свої функції, що підвищують ефективність реплікації вірусу. Наприклад, Nef звільняє тирозинову кіназу Lck, зв’язану з CD4, і замість неї підтягує до плазматичної мембрани протеїнкіназу, що фосфорилює білки по залишках серину і треоніну. Таким чином, Nef впливає прямо на передачу сигналу від T-клітинного рецептору. Vpu взаємодіє із специфічними залишками на цитоплазматичному кінці CD4, коли той ще знаходиться в ендоплазматичному ретикулюмі. Одночасний синтез gp160 і CD4 у інфікованих може призводити до їх зв’язування ще до виходу на мембрану. Vpu зв’язує молекули CD4 і направляє їх до деградації. Це дозволяє вихід gp160 із ендоплазматичного ретикулюму і його вбудову в віріони ВІЛ.

Як вірус поводить себе, потрапивши у клітину, і де він зберігається.

Вірус може зберігатися в клітинах:

1) у вигляді інтегрованого до клітинної ДНК (активовані Т-клітини, макрофаги, клітини пам’яті);

2) у вигляді неінтегрованого до клітинної ДНК (Т-клітини у спокої);

3) у вигляді віріонів, представлених на фолікулярних дендритних клітинах у зародкових центрах лімфоїдних органів.

Реплікація вірусу відбувається тільки в активованих клітинах. Отже, клітини пам’яті, Т-клітини у спокої та макрофаги є резервуарами зберігання вірусу, де він ніяк себе не проявляє і не може бути розпізнаним.

У інфікованих індивідів пропорція активованих клітин зростає, як відповідь на інфекцію, і саме в них вірус активно реплікує.

Таким чином, поширенню інфекції сприяє саме активація імунної відповіді. Вірус вибірково вбиває Т-клітини, що активуються у відповідь на нього, Фактично, відбувається клональна делеція вірус-специфічних клітин. Так само знищуються і Т-клітини, активовані іншими антигенами — розвивається стан імунодефіциту.

Зберігання вірусу в резервуарах у неактивному стані пояснило обмежену ефективність анти-вірусної терапія. Використання коктейлів препаратів, що заважають реплікації вірусу (азацитидин, азатимідин) в комбінації із інгібітором вірусної протеази, дозволило подовжувати асимптоматичний період хвороби, підвищувати рівні CD4⁺ клітин і полегшувати стан хворих. Але ці препарати не знищували вірус, що не реплікував, і швидко відбирали резистентні штами. Крім того, якщо в хворих вдавалося підняти рівень CD4⁺ клітин, вірус починав ефективно розмножуватися саме в цих клітинах.

Із наведеного зрозуміло, що довга асимптоматична фаза СНІДу є станом балансу між продукцією вірусу і його знищенням імунною системою. Активна відповідь на вірус призводить до виснаження імунної системи і припинення імунного контролю. В цей час вірус зберігається у клітинних резервуарах, головним з яких є клітини пам’яті, де він не піддається анти-вірусній терапії, оскільки не реплікує.

Чому знижується імунна відповідь на ВІЛ.

Час напівжиття вірусних часток — менше 6 годин. При первинній інфекції спочатку спостерігаються дуже високі рівні вірусу в плазмі крові — ~10⁶ копій РНК/мл. По мірі розвитку імунної відповіді ці рівні можуть знижуватися до 10³ копій/мл і зберігаються стабільними на протязі всього асимптоматичного періоду. Швидкість розвитку захворювання пропорційна кількості вірусів у крові.

Таким чином, утворюється певна рівновага продукції і виведення вірусу, яка підтримується в період асимптоматичної хвороби. Це означає, що в цей час імунна система ще здатна контролювати інфекцію.

У інфікованих спочатку спостерігаються дуже високі рівні вірус-специфічних CD8⁺ЦТЛ (до 10% всіх периферичних CD8⁺ клітин). Вони з’являються раніше за антитіла, але потім різко знижуються. Зниження відбувається за рахунок особливостей метаболізму вірусу:

1) зберігання в клітинах, недоступних дії ЦТЛ (наприклад, мікроглії, захищеній гематоенцефалічним бар’єром);

2) зберігання в резервуарах без активної реплікації;

3) зниження експресії МНС I в інфікованих клітинах;

4) підвищення експресії FasL на інфікованих клітинах: при контакті з Fas⁺ ЦТЛ останні гинуть шляхом апоптозу;

5) делеції CD4⁺Тх призводять до браку активації нових попередників ЦТЛ.

В результаті відбувається виснаження ЦТЛ, що існують, без поповнення із попередників.

Складність отримання вакцини до ВІЛ.

Визначення білка gp120 як головного у зв’язуванні вірусу з клітиною-мішенню дало надію на швидке створення вакцини проти СНІДу. Було швидко знайдено епітоп, антитіла проти якого начебто нейтралізували вірус і захищали тварин від зараження ВІЛ. Однак для людей вакцина, зроблена на основі мономерного gp120, виявилася неефективною: вона викликала низькі рівні антитіл, які не нейтралізували вірус. Виявилося, що антитіла, отримані до пептидів gp120, впізнавали інші епітопи, ніж антитіла, виділені у хворих (лінійні, а не конформаційні) і не враховували гликозилювання gp120 нативного вірусу. Більше того, антитіла, які утворювалися у інфікованих живим вірусом, при пасивному переносі іншим індивідам теж не давали імунітету і не знижували титрів вірусу у інфікованих. Це означало, що антитіла, які виробляються у відповідь на вірус, не завдають йому шкоди. Було показано, що вони не впізнають нативний вірус; вважають, що вони утворюються не до живих вірусів, а до продуктів їх деградації.

Таким чином, завдання створювачів вакцини виявилося дуже складним: викликати утворення антитіл, які були б більш ефективними, ніж ті, що утворюються при зараженні живим вірусом. Зараз відомо всього 3 моноклональних антитіла, здатних нейтралізувати вірус: два з них зв'язують різні епітопи на gp120, а третє впізнає ділянку gp41. Завдання ускладнюється тим, що штами вірусу, адаптовані в лабораторії, відрізняються від диких штамів; лабораторні є більш чутливими до нейтралізації.

Таким чином, незважаючи на великі досягнення в розумінні шляхів метаболізму вірусу в організмі, ефективної вакцини проти ВІЛ ще не створено. Натомість, запропоновано альтернативні вакцинуванню шляхи, що запобігають інфікуванню.

1) Використання розчинного CD4 — запобігає взаємодії gp120 з CD4⁺ клітинами.

2) Введення хемокінів, які блокують взаємодію gp120 з рецептором для хемокінів і знижують рівень експресії рецептору на клітині; так само поводять себе короткі позитивно заряджені пептиди;

3) Введення пептидів gp41: вони взаємодіють з мембраною клітини і запобігають зв’язуванню вірусного gp41;

4) Використання антитіл до всіх елементів взаємодії віруса з клітиною, що заважають утворенню фузогенного комплексу.

Зрозуміло, що ці методи ефективні як профілактичні і діють досить короткий час після застосування, на відміну від вакцин, які здатні створити довгостроковий захист. Тому створення вакцини проти СНІДу залишається одним із найважливіших завдань у боротьбі із цією хворобою. Разом із удосконаленням анти-вірусної терапії це дає надію на подолання однієї із суворіших хвороб ХХ століття