Строение и функционирование лактозного и триптофанового оперонов. Модель Жакоба-Моно.

Лактозный оперон интересен тем, что здесь в одной регуляторной системе используются оба принципиальных подхода — регуляция и связывание РНК-полимеразы, и ее перемещение через оператор.

Причем, существуют и другие опероны со сходным принципом организации. Примечательно, что все они являются индуцибельными и все контролируют распад (катаболизм) поступающих извне питательных веществ. В то же время не для всех таких веществ имеется оперонный принцип регуляции.

Лактозный оперон включает три гена. Из них первые два кодируют ферменты утилизации лактозы: пермеазу и Р-галактозидазу.

Пермеаза необходима для проникновения лактозы из внешней среды в клетку. Заметим, что даже при «выключенном» опероне имеется небольшое количество пермеазы. Поэтому при появлении во внешней среде лактозы какое-то количество ее может проникать внутрь и оказывать сигнальное воздействие на лактозный оперон.

Второй фермент р-галактозидаза катализирует распад лактозы на глюкозу и галактозу. Последние далее вступают в катаболические превращения, обеспечиваемые конститутивными ферментами. При «выключенном» опероне имеется небольшая активность и этого фермента. Это важно потому, что параллельно с основной реакцией (гидролизом лактозы) происходит и побочная — изомеризация лактозы в аллолактозу (где галактоза и глюкоза соединены не 1,4 а 1,6-гликозидной связью). И именно аллолактоза, а не лактоза, служит регулятором активности оперона.

Конкретно, аллолактоза, появляясь в клетке при наличии во внешней среде лактозы, связывается с лактозным репрессором. Этот белок кодируется специальным геном, имеет 4 субъединицы и в отсутствие аллолактозы связывается с оператором лактозного оперона, блокируя транскрипцию генов оперона. Аллолактоза же, связываясь с репрессором, снижает его сродство к оператору, что деблокирует гены. Таким образом, при появлении вне клетки лактозы происходит активация лактозного оперона и интенсивное образование в клетке ферментов утилизации лактозы.

Но это имеет место только тогда, когда во внешней среде нет глюкозы. Если же там достаточно глюкозы, то биологического смысла в использовании лактозы уже нет. В соответствии с этим, глюкоза препятствует активации лактозного оперона даже в присутствии больших количеств лактозы.

Достигается это путем влияния на связывание РНК-полимеразы с промотором. Дело в том, что промоторная область в лактозном опероне (и в сходных с ним оперонах) шире, чем обычно, и способна связывать не только РНК-полимеразу, но и особый белок САР, белковый активатор катаболизма.

В отсутствие САР РНК-полимераза очень плохо связывается с промотором лактозного оперона, а САР изменяет структуру промотора, резко повышая его сродство к РНК-полимеразе. По существу, САР играет у бактерий примерно ту же роль, что общие факторы транскрипции у эукариот. Только САР необходим для деятельности лишь некоторых оперонов, тогда как общие факторы транскрипции — для функционирования любого гена эукариот.

Связывание САР с промотором происходит, только если САР находится в комплексе с циклическим АМФ (цАМФ). Последний же образуется из АТФ под влиянием фермента аденилатциклазы.

В отсутствие глюкозы активность аденилатциклазы высокая, в клетке — достаточная концентрация цАМФ, поэтому САР связан с лактозным промотором, к которому легко присоединяется РНК-полимераза. В этих условиях активность оперона зависит только от того, свободен или нет оператор, т. е от наличия во внешней среде лактозы.

Если же имеется глюкоза, то активность аденилатциклазы оказывается сниженной, отчего в итоге промотор остается без САР и практически теряет сродство к РНК-полимеразе. Лактозный оперон не функционирует, а в качестве питательного субстрата используется глюкоза.

В триптофановом опероне, как и в лактозном, тоже имеется двойной механизм регуляции. Во-первых, как обычно, регулируется перемещение РНК-полимеразы по оператору. Вторым же (и более чувствительным) объектом регуляции является не связывание РНК-полимеразы с промотором, а окончание транскрипции на аттенюаторе.

Аттенюатор — это присутствующий в некоторых оперонах участок ДНК между оператором и генами, на котором при определенных условиях прекращается транскрипция оперона.

Как правило, опероны, имеющие аттенюатор, являются репрессибельными и контролируют синтез (анаболизм) того или иного необходимого компонента — например, редкой аминокислоты: триптофана, гистидина, фенилаланина.

Триптофановый оперон включает 5 цистронов кодирующих четыре фермента заключительного этапа образования триптофана. При этом последний фермент содержит субъединицы двух видов, отчего кодируется двумя цистронами. Вместе с тем, ген предпоследнего фермента цепочки, по-видимому, находится где-то вне данного оперона.

Вслед за промотором и оператором в оперонах этого типа находится т. н. лидерный отдел; именно он оканчивается аттенюатором.

В процессе транскрипции этого отдела образуется лидерный участок мРНК. Последний тут же связывает рибосому и начинает трансляцию с образованием лидерного пептида (ЛП). Ключевая особенность последнего - среди его 14 аминокислотных остатков содержатся 2 остатка триптофана, т. е. той самой аминокислоты, синтез которой контролируется опероном.

Когда в клетке достаточно триптофана, то синтез лидерного пептида идет без задержки: образующая его рибосома не отстает от РНК-полимеразы. В этих условиях при достижении РНК полимеразой аттенюатора с высокой долей вероятности срабатывает сигнал об окончании транскрипции: РНК-полимераза диссоциирует от ДНК и гены не считываются.

Таким образом, триптофан, быстро включаясь в лидерный пептид, блокирует через аттенюаторный механизм синтез ферментов, необходимых для его образования. Правда, блокирование это - не полное, т. к. сохраняется небольшая вероятность того, что РНК-полимераза все же преодолеет аттенюаторный участок.

Если, наоборот, концентрация триптофана в клетке низкая, то рибосома задерживается с синтезом лидерного пептида и отстает от РНК-полимеразы. Это так меняет конфигурацию ДНК или лидерного отдела мРНК, что сигнал об окончании трансляции на аттенюаторе не срабатывает. Каждая молекула РНК-полимеразы проходит этот «опасный» участок и транскрибирует гены. Т. е. активно синтезируются ферменты необходимые для пополнения запаса триптофана в клетке.

Очевидная роль терминаторов транскрипции состоит в прекращении синтеза РНК в концах оперонов, что обеспечивает независимую регуляцию экспрессии различных участков ДНК. Но терминаторы встречаются и внутри оперонов. Эффективность этих «внутренних» терминаторов может регулироваться, что позволяет клетке изменять скорость синтеза РНК на участках ДНК, расположенных за терминаторами, не меняя скорости синтеза РНК на участках, расположенных перед терминаторами.

р-независимая терминация. РНК-полимераза способна терминировать синтез РНК лишь на некоторых терминаторах, нуклеотидная последовательность в районе которых отличается двумя характерными особенностями. В них по ходу транскрипции сначала идет GC-богатый участок, обладающий центральной симметрией, а затем участок из 4—8 расположенных подряд А в значащей нити. Транскрипция заканчивается на конце олигоА последовательности или сразу за ней. После прохождения РНК-полимеразой GC-богатого участка с центральной симметрией в РНК-продукте возникает шпилька, приводящая к остановке РНК-полимеразы и разрушению части РНК-ДНК гибрида транскрибирующего комплекса. Оставшаяся часть РНК-ДНК гибрида, содержащая концевую олигоU последовательность РНК, легко плавится ввиду относительной нестабильности rU-dA-пар, что приводит к освобождению РНК-продукта. Первым из комплекса освобождается РНК- продукт, а затем РНК-полимераза.

Таким образом, эффективность терминации зависит от баланса стабильности различных РНК: РНК и РНК : ДНК двойных спиралей. В энергетику этого баланса вносит вклад и РНК-полимераза, так как определенные мутации, затрагивающие РНК-полимеразу, влияют на эффективность терминации. Эти же мутации влияют и на продолжительность пауз транскрипции, что подтверждает представление о том, что подготовительной стадией терминации является пауза.

Многие терминаторы узнаются РНК-полимеразой только с помощью фактора терминации, названного р. Этот белок с молекулярной массой 46 кД обладает РНК-зависимой нуклеозидтрифосфатазной активностью, обязательной для терминирующего действия. НТФазная активность фактора р проявляется только в комплексе с однонитевой РНК. Наибольшей НТФазной активностью р-фактор обладает в присутствии полицитидиловой кислоты. Фактор р агрегирует с образованием гексамера, способного связываться с РНК- В комплексе с РНК гексамер защищает в ней от действия РНКазы 80—90 нуклеотидов, так что каждый мономер связывает по 12—14 нуклеотидов РНК. Фактор р присоединяется к РНК-продукту до того, как РНК-полимераза достигает терминатора.

В местах р-зависимой терминации РНК-полимераза делает паузы в отсутствие р-фактора, поэтому считается, что роль р-фактора заключается в вытеснении РНК из транскрипционного комплекса в местах пауз. Рассматриваются две модели. Согласно одной из них, фактор движется по синтезируемой РНК, а в местах пауз догоняет РНК-полимеразу и вытесняет РНК-продукт. Другая модель основана на том, что пирофосфат подавляет НТФазную активность р-фактора. Согласно этой модели, р-фактор движется за РНК-полимеразой без отставания, но при нормальной скорости элонгации ингибируется пирофосфатом, высвобождающимся при синтезе РНК. Активация р-фактора происходит лишь в местах пауз, где синтез цепи РНК временно останавливается, что приводит к прекращению освобождения пирофосфата.

Определение нуклеотидной последовательности дНК (секвенирование)

Передовым достижением стала разработка методов анализа первичной структуры ДНК, то есть последовательности нуклеотидов, которое послужило началом становления нового научного направления – геномики.

Поэтому вполне оправданным выглядит решение Нобелевского комитета о присуждении в 1980 г. Нобелевской премии по химии У. Гилберту и Ф. Сэнгеру за разработку методов секвенирования ДНК путем химической деградации и ферментативного построения соответственно

Важным подспорьем в ускорении секвенирования стало открытие полимеразно-цепной реакции. Премия 1993 г. по химии была присуждена за метод амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции.

Успехи в определении нуклеотидной последовательности ДНК (секвенировании) были подготовлены как всем развитием молекулярной биологии (обнаружение рестрикционных эндонуклеаз, других ферментов обмена нуклеиновых кислот, плазмидных векторов, разработка методов молекулярного клонирования, методов электрофоретического разделения нуклеиновых кислот), так и накопленным знанием в области химии нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот, где вклад отечественных ученых весьма значителен.

Все составляющие процесса секвенирования ДНК, как тем, так и другим методами за годы прошедшие с их разработки, подверглись сильной модификации, и производительность сегодняшнего секвенирования ДНК просто поражает.