ПО СЭНГЕРУ

 

В основе этого метода секвенирования (также называемого секвенированием путем терминации цепи), лежит ферментативное построение комплементарной цепи ДНК на одноцепочечной матрице. При этом в разных местах цепи ДНК происходит ингибировании ее дальнейшего роста.

Компонентами реакции являются: одноцепочечная матрица ДНК; короткая затравочная молекула, комплементарная определенному участку матрицы; ДНК-полимераза (Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I E. coli); 2´-дезоксинуклеотид 5´-трифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ или просто дНТФ); 2´,3´-дидезоксинуклеотид 5´-трифосфаты (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ или просто ддНТФ); реакционный буфер с ионами Mg2+.

 

 

Рисунок 1 – Принцип секвенирования методом Максама-Гилберта

 

Главным этапом этого процесса является терминация построения комплементарной цепи ДНК. Она происходит при включении ДНК-полимеразой модифицированных аналогов природных субстратов дидезоксинуклеотид трифосфатов, являющихся ингибиторами ДНК-полимеразы. Рост цепи таким образом прерывается из-за отсутствие второго гидроксильного остатка в З'-положении рибозного кольца у дидезоксипроизводных и невозможности присоединения к ним следующего нуклеотида. Поскольку в четырех реакционных пробирках (по типу оснований – А, С, G и Т) присутствует огромное количество молекул секвенируемой ДНК, во много раз превосходящее ту длину фрагмента, которую могла построить ДНК-полимераза, то по теории вероятности каждое положение этого типа оснований во фрагменте ДНК оказывается представленным соответствующим ддНМФ.

Еще одним важным моментом является разный размер полученных фрагментов ДНК. Разница в размерах определяется тем, что все З'-концы фрагментов вновь синтезируемой цепи ДНК во всех четырех реакционных пробирках были терминированы соответствующими ддНМФ и, таким образом, представляли собой полный набор всех возможных длин в пределах секвенируемого участка, построенного ДНК-полимеразой. Что касается 5'-конца всех этих фрагментов ДНК, принадлежащих новой цепи, то он должен быть для всех фрагментов строго одинаковым и принадлежать 5'-концу исходной затравочной молекулы.

Продукты реакций терминирования подвергаются денатурации и одноцепочечные меченые фрагменты разделяются по длине посредством электрофореза в полиакриламидном геле, позволяющим разделять фрагменты ДНК, отличающиеся всего на один нуклеотид.

После электрофореза гель экспонировался на рентгеновскую пленку. С проявленной пленки “читали” последовательность нуклеотидов секвенируемого участка ДНК.

На рисунке 2 схематично показан описанный выше процесс.

 

 

Рисунок 2 – Принцип секвенирования методом Сенгера








Дата добавления: 2015-08-01; просмотров: 643;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.007 сек.