Методи іммобілізації ферментів

Існує два основних методи іммобілізації ферментів: фізичний і хімічний.

Фізична іммобілізація ферментів являє собою включення ферменту в таке середовище, у якому для нього доступною є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичній іммобілізації фермент не зв'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існує чотири типи зв'язування ферментів:

– адсорбція на нерозчинних носіях;

– включення в пори гелю;

– просторове відділення ферменту від іншого обсягу реакційної системи за допомогою напівпроникної перегородки (мембрани);

– включення у двофазне середовище, де фермент розчинний і може перебувати тільки в одній з фаз.

Адсорбційна іммобілізація є найбільш старим з існуючих способів іммобілізації ферментів, початок їй було покладено ще у 1916 р. Цей спосіб досить простий і досягається при контакті водного розчину ферменту з носієм. Після відмивання неадсорбованого білка іммобілізований фермент готовий до використання. Утримання адсорбованої молекули ферменту на поверхні носія може забезпечуватися за рахунок неспецифічних ван-дер-ваальсових взаємодій, водневих зв'язків, електростатичних і гідрофобних взаємодій між носієм і поверхневими групами білка. Внесок кожного з типів зв'язування залежить від хімічної природи носія й функціональних груп на поверхні молекули ферменту. Взаємодії з носієм можуть виявитися настільки сильними, що сорбція біокаталізатору може супроводжуватися руйнуванням його структури. Наприклад, при адсорбції деяких рослинних клітин на гранулах цитодекса клітинна стінка деформується, повторюючи рельєф поверхні часток носія. Перевагою методу адсорбційної іммобілізації є доступність і дешевина сорбентів, що виступають у ролі носіїв. Їм також можна надати будь-яку конфігурацію й забезпечити необхідну пористість. Важливий фактор – простота застосовуваних методик. При адсорбційному зв'язуванні можна вирішити й проблему очищення ферменту, тому що зв'язування білка з носієм у багатьох випадках досить специфічне. На жаль, міцність зв'язування ферменту з носієм не завжди досить висока, що обмежує застосування методу. До недоліків адсорбційної іммобілізації варто віднести відсутність загальних рекомендацій, що дозволяють зробити правильний вибір носія й оптимальних умов іммобілізації конкретного ферменту.

Деяких з перерахованих ускладнень можна уникнути при іммобілізації ферментів шляхом включення в гель. Суть цього методу іммобілізації полягає в тому, що молекули ферменту включаються в тривимірну сітку з тісно переплетених полімерних ланцюгів, які утворюють гель. Середня відстань між сусідніми ланцюгами в гелі менше розміру молекули включеного ферменту, тому він не може покинути полімерну матрицю й вийти в навколишній розчин, тобто перебуває в іммобілізованому стані. Додатковий внесок у втримання ферменту в сітці гелю можуть вносити також іонні й водневі зв'язки між молекулою ферменту й навколишніми її полімерними ланцюгами. Простір між полімерними ланцюгами в гелі заповнено водою, на частку якої доводиться значна частина всього обсягу гелю. Наприклад, широко застосовувані гелі полімерів акрилової кислоти залежно від концентрації полімеру і його природи містять від 50 до 90% води.

Для іммобілізації ферментів у гелі існує два основних способи. При одному з них фермент поміщають у водний розчин мономера, а потім проводять полімеризацію, у результаті чого утворюється полімерний гель із включеними в нього молекулами ферменту. У реакційну суміш часто додають також біфункціональні (містять у молекулі два подвійні зв'язки) зшиваючі агенти, які надають полімеру структуру тривимірної сітки. В іншому випадку фермент вносять у розчин готового полімеру, який тільки потім переводять у гелеподібний стан. Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення в полімерний гель дозволяє створювати препарати будь-якої геометричної конфігурації, забезпечуючи при цьому рівномірний розподіл біокаталізатора в обсязі носія. Метод універсальний, застосовується для іммобілізації практично будь-яких ферментів, поліферментних систем, клітинних фрагментів і клітин. Фермент, включений у гель, стабільний, надійно захищений від інактивації внаслідок бактеріального зараження, тому що великі клітини бактерій не можуть проникнути в мілкопористу полімерну матрицю. У той же час, ця матриця може створювати значні перешкоди для дифузії субстрату до ферменту, знижуючи каталітичну ефективність іммобілізованого препарату, тому для високомолекулярних субстратів даний метод іммобілізації не застосовується взагалі.

Загальний принцип іммобілізації ферментів з використанням мембран полягає в тому, що водний розчин ферменту відокремлюється від водного розчину субстрату напівпроникною перегородкою. Напівпроникна мембрана легко пропускає невеликі молекули субстрату, але непереборна для великих молекул ферменту. Існуючі модифікації цього методу розрізняються лише способами одержання напівпроникної мембрани і її природою. Водний розчин ферменту можна включати усередину мікрокапсул, які представляють собою замкнуті сферичні пухирці з тонкою полімерною стінкою (мікрокапсулювання). При подвійному емульгуванні утворюється водна емульсія із крапель органічного розчину полімеру, який містить, у свою чергу, ще більш дрібні краплі водного розчину ферменту. Через якийсь час розчинник загускає, утворюючи сферичні полімерні частки з іммобілізованим у них ферментом. Якщо замість водонерозчинного полімеру використовуються рідкі вуглеводні з високою молекулярною масою, метод називається іммобілізацією шляхом включення в рідкі мембрани. До модифікацій методу іммобілізації ферментів з використанням напівпроникних оболонок відноситься також включення у волокна (при цьому замість крапель, що містять ферменти, використовують нитки) і включення в ліпосоми. Застосування систем мембранного типу дозволяє одержувати іммобілізовані препарати з високим вмістом ферменту. Метод, як і попередній, досить універсальний, тобто застосовується як до ферментів, так і до клітин, а також до їх фрагментів. Завдяки високому відношенню поверхні до обсягу й малої товщини мембрани вдається уникнути значних дифузійних обмежень швидкості ферментативних реакцій. Основний недолік мембранних систем – неможливість ферментативного перетворення високомолекулярних субстратів.

При іммобілізації ферментів з використання систем двофазного типу обмеження руху переміщення ферменту в обсязі системи досягається завдяки його здатності розчинятися тільки в одній з фаз. Субстрат і продукт ферментативного перетворення розподіляються між обома фазами відповідно до їх розчинності в цих фазах. Природа фаз підбирається таким чином, що продукт накопичується в тій з них, де фермент відсутній. Після завершення реакції цю фазу відокремлюють і екстрагують із неї продукт, а фазу, що містить фермент, знову використовують для проведення чергового процесу. Одним з найважливіших переваг систем двофазного типу є те, що вони дозволяють здійснювати ферментативні перетворення макромолекулярних субстратів, які неможливі при застосуванні твердих носіїв з обмеженим розміром пор.

Головною відмітною ознакою хімічних методів іммобілізації є те, що шляхом хімічної взаємодії на структуру ферменту в його молекулі створюються нові ковалентні зв'язки, зокрема між білком і носієм. Препарати іммобілізованих ферментів, отримані із застосуванням хімічних методів, володіють принаймні двома важливими достоїнствами. По-перше, ковалентний зв'язок ферменту з носієм забезпечує високу міцність кон’югату. При широкому варіюванні таких умов, як рН і температура, фермент не десорбується з носія й не забруднює цільових продуктів реакції. Це особливо важливо при реалізації процесів медичного й харчового призначення, а також для забезпечення стійких, відтворюваних результатів в аналітичних системах. По-друге, хімічна модифікація ферментів здатна призводити до істотних змін їхніх властивостей, таких як субстратна специфічність, каталітична активність і стабільність. Хімічна іммобілізація ферментів є мистецтвом, рівень якого визначається, у першу чергу, умінням експериментатора. Основне завдання експериментатора полягає у формуванні нових ковалентних зв'язків у молекулі ферменту при використанні його функціональних груп, несуттєвих для прояву його каталітичної активності. При хімічній модифікації ферменту його активний центр бажано захищати. При зіставленні різних прийомів іммобілізації хімічні методи для великомасштабних біотехнологічних процесів здаються малопривабливими через складність і дорожнечу. У промислових процесах, як правило, використовуються методи фізичної іммобілізації.