Получение трансгенных растений

1При действии фитопатогенов в растениях включается каскад меха­низмов защитных реакций. При этом активные ответные реакции в расте­ниях могут проходить по двум основным направлениям: во-первых, в от­вет на инфекцию начинается синтез соединений, являющихся токсичны­ми и ограничивающих жизнедеятельность патогенов, что в конечном итоге приводит к их гибели. Во-вторых, в качестве защитного ответа мо­гут создаваться структурные барьеры, которые предотвращают повреж­дение растений и распространение патогенов, что достигается лигнификацией клеточных стенок растений, либо укреплением клеточных стенок за счет гликопротеидов, богатых гидроксипролином и других соедине­ний, так называемых экстенсинов, что приводит к защите тканей от по­вреждения фитопатогенами.

В ответ на инфицирование вирусами, бактериями и грибами индуци­руются специфические РR-белки (pathogenesis related proteins), в том чис­ле и наиболее изученные хитиназы и β-1,3-глюканазы. Эти ферменты ингибируют рост грибов, а также некоторых видов бактерий.

Экспериментально был доказан фунгицидный эффект белков хитиназ и глюканаз, а также их кодирование одиночными генами. Поэтому гены хитиназы и глюканазы были использованы в генно-инженерных работах по получению трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам. Были получены трансгенные растения табака, хлопка, кукурузы, рапса, томата, риса, картофеля, люцерны, турнепса и других, экспрессирующих ген хитиназы под контролем промотора 358 СаМV. У этих растений на­блюдалась устойчивость к грибной инфекции. В настоящее время полу­чены трансгенные сорта табака, рапса, томатов, картофеля с повышенной устойчивостью к Rhizoctoniа, растения табака — к Cercospora nicotiana.

Другую группу соединений, также обладающих фунгицидным эф­фектом, представляют низкомолекулярные белки (40—50 кДа), к кото­рым относятся цистеиновые белки растений, ингибиторы галактуроназ, растительные дефензины, группа МF-белков. Все эти белки обычно не­специфически повышают устойчивость растений к различным грибным и бактериальным инфекциям. Трансгенные растения, экспрессирующие этот белок, обладают устойчивостью как к грибной, так и к вирусной ин­фекции.

В процессе изучения взаимоотношений вирус — растение было во­влечено большое число различных методов. Только их комбинирование могло принести результаты по получению растений, устойчивых к вирус­ной инфекции. За последние годы в этом направлении был сделан замет­ный рывок, что напрямую связано с более детальным пониманием орга­низации генома и функционирования вирусных генов. В настоящее время для получения растений, устойчивых к вирусной инфекции, с помощью генно-инженерных технологий существует ряд подходов, позволяющих получить трансгенные растения, трансформированные геном белка обо­лочки вируса, что приводит к уменьшению инфицированности и ингибированию размножения вируса. Таким методом были получены растения табака и картофеля, трансформированные геном белка оболочки вируса табачной мозаики, что привело к появлению стойкого антивирусного эф­фекта у трансгенных растений.

В настоящее время получены линии табака, которые, помимо устой­чивости к ВТМ, резистентны к вирусу тыквенной мозаики. Были также получены растения картофеля и кукурузы, устойчивые к вирусам скручи­вания листьев, и растения ячменя, резистентные к вирусу карликовости. В настоящее время получен и выращивается сорт тыквы, обладающий ус­тойчивостью сразу к трем вирусам.

Еще одним подходом к получению устойчивых к патогенам растений является трансформация растительных клеток генами, кодирующими ферменты пути биосинтеза фитоалексинов, проявляющих фунгицидное и антимикробное действие. Трансформация этими генами растений томата и картофеля значительно повысила устойчивость к фитофторозу и фузариозу, а табака—к серой

гнили. В настоящее время получены четыре трансгенных коммерческих сор­та картофеля, устойчивые к Y вирусу (РVY) и вирусам скручивания ли­стьев (РLRV), сорт тыквы, устойчивый одновременно к трем различным вирусам, сорт папайи, устойчивый к круговому вирусу папайи (РRV).

2Одним из основных направлений биотехнологии растений является получение культурных растений, устойчивых к воздействию гербицидов. Гербициды широкого спектра действия, уничтожая сорные травы, оказы­вают угнетающее действие и на посевы. Получение устойчивых к герби­цидам растений ведется в двух направлениях: во-первых, прямая селек­ция устойчивых к гербицидам форм растений (в основном, путем скре­щивания с дикими видами растений, устойчивых к гербицидам), во-вторых, получение трансгенных растений путем введения генов, экпрессия которых приводит к гербицид-резистентности. Теоретической основой получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, являются данные о молекулярных механизмах возникновения устойчивости к гер­бицидам и выделения генов как бактериального, так и растительного про­исхождения, определяющих этот признак. Действие гербицидов проявля­ется в подавлении метаболизма растительных клеток: ингибировании биохимических процессов прежде всего фотосинтеза (атразин, симазин, диурон) и синтеза аминокислот (глифосат, сульфон ил мочевина, биала-фос). Устойчивость к гербициду возникает либо в результате изменения сродства гербицида с его ферментом-мишенью, либо непосредственно ингибированием молекулы гербицида. Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной ин­женерии прежде всего основывается на изучении молекулярных меха­низмов толерантности и включает следующие этапы: выявление мише­ней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений/бактерий, ус­тойчивых к данному гербициду (в качестве источника генов резистентности), идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. Действие гербицида атразина основано на его связывании с хлоропластным мембранным белком Qb, который кодируется геном рЬс А. Ген рbс А был выделен из генома некоторых сорняков. Было показано, что ус­тойчивость к гербициду связана с возникновением точечной мутации в гене рbсА, что приводит к замене в белке аминокислотного остатка серина на глицин. Такие замены в белке Qb приводят к резкому уменьшению связывания гербицида с ферментом-мишенью. В результате возникает устойчивость к гербициду. Мутантный ген рЬс А был встроен в векторные конструкции для трансформации растений. Полученные трансгенные рас­тения были устойчивы к атразину. Аналогично показано, что замена аланина на аргинин в белке EPSP-синтетазы, который кодируется геном аrо А Е.соli, приводит к воз­никновению устойчивости к действию гербицида глифосата. Это было использовано для трансформации клеток табака, томатов, сахарной свек­лы и картофеля мутантным геном аrо А и получения трансгенных расте­ний, устойчивых к гербициду. Введение в геном растений бактериального гена bar приводит к появ­лению устойчивости к гербициду ВАSТА. Было показано, что белок, ко­дируемый bar-геном,- фосфинотрицинацетилтрансфераза - ацетилирует активный компо-

нент гербицида фосфинотрицин, что приводит к его инактивации. Получены сорта трансгенного риса (1995), сорго (1995), пшеницы (1994) и ряда других растений. В последнее время bar-ген стал использоваться и в качестве селективного маркера в генно-инженерных векторах. Введение в геном риса гена, кодирующего фермент протопорфирино-генсинтетазу (Protox, выделенного из бактерий В. subtillis, привело к по­вышению устойчивости трансгенных растений к гербицидам дифенилэфирового ряда. При этом был показан механизм антигербицидного дей­ствия: повышенная экспрессия этого белка Ргоtох нейтрализует действие гербицида, чем и обусловлено повышение устойчивости к нему. При этом была показана прямая зависимость между числом встроенных копий гена и уровнем устойчивости.

В настоящее время в странах Северной Америки и Европе разрешены к применению более 20 сортов трансгенных растений, устойчивых к гер­бицидам, таких важных сельскохозяйственных культур, как кукуруза, хлопок, рис, соя, пшеница, картофель, томаты, лен. Проходят полевые ис­пытания трансгенные сорта клубники, сахарной свеклы и некоторых цве­точных культур. Всего в мире трансгенными сортами и гибридами, ус­тойчивыми к гербицидам, засеяно около 34 млн. гектаров, или 80% от всех посевов трансгенных сортов. В целом можно говорить о том, что получение трансгенных растений является одним из наиболее бурно развивающихся направлений биотех­нологии. К февралю 2001 г. в странах, с разрешенным использованием ге­нетически модифицированных растений были проведены испытания и разрешены к коммерческому использованию 78 сортов трансгенных рас­тений 18 возделываемых культур.