ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ БЕЛКА

Поглощение (абсорбцией) света называется явление уменьшения энергии световой волны при ее распространении в веществе вследствие преобразования энергии волны в теплоту и другие виды энергии. Это происходит одновременно с рассеянием света. Рассеяние света происходит в средах при условии, что размеры неоднородностей соизмеримы с длиной волны света. При рассеянии света энергия сохраняет свою электромагнитную природу.

Поглощение света в веществе описывается законом Бугера:

, (1)

где J₀ и J – интенсивности плоской монохроматической световой волны на входе и выходе слоя вещества толщиной d; a - коэффициент поглощения зависящий от длины волны l света, химической природы и состояния вещества и не зависящий от интенсивности света. При интенсивность света J по сравнению с J₀ уменьшается в «е» раз (т.е. » 2,72 приблизительно в три раза).

Показатель поглощения характеризуется поглощательную способность вещества.

Постепенное убывание интенсивности света при прохождении через среду вследствие рассеяния также подчиняется закону Бугера, формула (1) которого с учетом поглощения и рассеяния принимает вид:

, (2)

где - s - показатель ослабления света вследствие рассеяния.

Исследования поглощения монохроматического света растворами окрашенных веществ (при условии, что расворитель не поглощает света данной длины волны и раствор имеет невысокую концентрацию). Бер показал, что оно также подчиняется закону Бугера.

Закон Бера гласит:

«показатель поглощения a прямо пропорционален концентрации вещества в растворе:

, (3)

где х – показатель поглощения для раствора единичной концентрации». Для разных веществ зная (3) и (1) имеем:

- закон Бугера-Бера (4)

или в системе десятичных логарифмов

, где .

Отношение - называют коэффициентом пропускания или прозрачностью, а величину - оптической плотностью. Учитывая выше приведенную формулу оптическая плотность раствора

D = xcd (5)

где D – оптическая плотность,

с – концентрация вещества,

х – коэффициент экстинкции х = 0,434х^’.

На практике закон Бугера-Бера выполняется в некоторых пределах, концентрации (до значения оптической плотности D=0,3 до D=1,5. Эти условия подбирают, изменяя концентрацию или длину оптического пути (толщину кюветы).

Оптическая плотность раствора зависит от длины волны измеряемого света и не зависит от его интенсивности. Кривая выражающая эту зависимость называется спектром поглощения.

II. Описание экспериментальной установки (СФ-26)

Спектрофотометр предназначен для измерения коэффициента пропускания жидких и твердых веществ в области спектра от 186 до 110 Нм.

Спектрофотометр состоит из монопроматора с измерительным прибором 2, кюветного отделения 3, камеры 4 с фотоприемниками и усилителем и осветителя 5 с источниками излучения и стабилизатором.

Основной частью монохоматора является призма которая поворачивает при вращении рукоятки 6 одновременно происходит перемещение школы 7 длин волн. Раскрытие входной и выходной щелей осуществляется с помощью рукоятки 8. Щели открываются в пределах от 0,01 до 2 мм.

В спектрофотометре используются два источника сплошного спектра: дейтериевая лампа для работы в области спектра от 186 до 350 нм и лампа накаливания для работы в области спектра от 340 до 1100 нм. Смена источников излучения производится в диапазоне от 340 до 350 нм путем переключения зеркального конденсатора рукояткой 9.

Кюветное отделение 3 предназначено для установки измеряемых и контрольных образцов (образцов сравнения). Для крепления плоских твердых образцов в кюветном отделении служит держатель с четырьмя окнами и пружинами, позволяющий устанавливать и измерять пропускание образцов толщиной от 0,5 до 2 мм, шириной от 8 до 15 мм.

Для исследования жидкостей используются прямоугольные кюветы из кварцевого стекла для слоя жидкости толщиной 10 мм. Кюветы помещаются в держатель с четырьмя гнездами. Держатели твердых образцов и прямоугольных кювет устанавливаются в каретку стороной с белой точкой к оператору, предельно близко к выходному окну монохрометра. Каретка с образцами перемещается с помощью рукоятки 10 и может фиксироваться в четырех положения: «1», «2», «3», и «4», соответствующих четырем кюветам.

Измерение коэффициентов пропускания образцов производится при плотно закрытой крышке кюветного отделения.

Переключение элементов производится с помощью рукоятки 11. если рукоятка находится в положении «Ф», в схему включен сурьмяно-цезиевой фотоэлемент, и в положении «К» в схему включен кислородно-цизиевой фотоэлемент.

В камере 4 находится осушительный патрон с силикагелем. Шкалы измерительного прибора 2, оцифрованные в процентах пропускания Т и единицах оптической плотности Д.

На основании расположены сигнальная лампа 12 и тумблер сеть: сигнальная лампа 13 (Д), показывающая включение дейнгерневой лампы; сигнальная лампа 14 (Н), показывающая включение лампы накаливания, рукоятка 15 включения регистров компенсации при растяжке 10-процентного диапазона на всю шкалу, имеющая 10 положений, обеспечивающих работу в диапазонах коэффициентов пропускания от 110 до 100, 100-90…. от 10-0; рукоятка 16 отсчет для выбора шкалы измерений, имеющая четыре положения. Положение «х1» рукоятки «отсчет» используется для измерения в диапазоне от 100 до 0; положение «х0,1» используется для растяжки 10-процентного диапазона на всю шкалу измерительного прибора при включенном компенсаторе; положение калибр используется для установки 100-процентного отсчета при работе с сильно поглощающими образцами. В этом случае измерения проводят с более широкими щелями для усиления светового потока, положение «х0,01» используется для измерения образцов с пропусканием меньше 10% для растяжки одного процента из диапазона от 0 до 10% в 100 раз на всю шкалу измерительного прибора (растяжка одного процента из диапазона от 2 до 10% производится при включенном компенсаторе).

На передней стенке камеры 4 расположена рукоятка 17 шторки, рукоятка 18 установки нуля, рукоятка 19 установки чувствительности.

Установка нуля осуществляется потенциометром с двойной регулировкой (грубой и тонкой), поэтому необходимо пользоваться им с большой осторожностью, не прилагая усилий.

Панель стабилизатора показана на рис. 2.

Ось 1 резистора для регулировки разрядного тока, ось 2 резистора для регулировки рабочего тока накала дейтериевой лампы, тумблер 3 и клеммы 4 для включения амперметра в цепь стабилизатора при установке разрядного тока и для включения амперметра в цепь накала дейтериевой лампы при установке рабочего тока накала лампы, предохранитель 5, клемма 6 для заземления и сетевая розетка 7.

III. Порядок выполнения работы

1. Приготовьте раствор сыворочного альбумина (яичного альбумина или пепсина) в воде, имеющий концентрацию 5 мг/мл.

2. Измерить оптическую плотность раствора при 280 ммк в кварцевых прямоугольных кюветах, которая должна быть равна ~ 0,5. При разведении раствора пользоваться формулой D = с e l.

3. Установите в рабочее положение фотоэлемент и источник излучения, соответствующие выбранному спектральному диапазону измерений.

4. Закройте фотоэлемент, поставив рукоятку 17 шторки в положение ЗАКР., и рукояткой 8 установите ширину щели примерно 0,1 мм..

5. Включите тумблер СЕТЬ, должна загореться сигнальная лампа СЕТЬ и сигнальная лампа D или сигнальная лампа Н в соответствии с выбранным источником (стабильная работа СФ-26) или другого спектрофотометра после включения в течение 1 часа).

6. Для включения после лампы накаливания дейтериевой лампы переключите конденсор рукояткой 9; после минутного прогрева лампа автоматически загорается, одновременно загорается и соответствующая индикаторная лампа.

7. Установите требуемую длину волны, вращая рукоятку 6 в сторону увеличения длин волн. Если при этом шкала повернется на большую величину, то возвратите ее назад на 3-5 нм и снова подведите к требуемому делению.

8. Поставьте рукоятку 19 в положение «1» (рабочее положение). Если поток излучения недостаточен измеряемый и контрольный образцы значительно поглощают излучение, установите рукоятку в положение «2», «3» или «4». При работе в положении КАЛИБР или «х0,01» рукоятку 16 рукоятку 19 установите также в одно положение «2», «3», «4».

9. Установите на пути потока излучения контрольный образец, перемещая каретку 10.

10. При отсутствии образца сравнения величина потока, проходящего через свободное окно держатся фильтров, принимается за 100% пропускания.

11. Установите стрелку измерительного прибора на нуль рукояткой 18 НУЛЬ.

12. Откройте фотоэлемент, поставив рукоятку 17 шторки в положение ОТКР.

13. Установите стрелку измерительного прибора на деление «100%», вращая рукоятку 8 механизма изменения ширины щели.

14. Установите в рабочее положение измеряемой образец, перемещая каретку рукояткой 10, и снимите отсчет по шкале оптической плотности D через каждые 5 нм в интервале 220-320 нм.

15. Выведите из потока излучения измеряемый образец и введите контрольный образец при этом стрелка измерительного прибора должна вернуться к делению «100%».

16. Данные эксперимента занесите в таблицу 1.

17. Постройте кривую спектра поглощения, откладывая по оси абсцисс длину волны, а по оси ординат оптическую плотность раствора сывороточного альбумина.

Таблица 1