ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Специфическая диагностика клещевого энцефалита проводится вирусологическими и серологическими методами.

Целью вирусологического исследования является выделение вируса из организма больного или умершего человека. При обследовании материала от умерших в раннем периоде болезни, когда нет возможности выявить динамику специфических антител, выделение возбудителя остаётся единственным методом диагностики. Однако отрицательный результат вирусологического исследования не исключает диагноза, так как успех во многом зависит от того, в какой стадии заболевания получен материал для выделения вируса, а также от соблюдения условий транспортировки. Длительность периода вирусемии не превышает 7 дней от начала заболевания. При обследовании в первые 4 дня заболевания частота выделения вируса из крови и спинномозговой жидкости достигает 40%.

Для проведения вирусологических исследований отбирают пробы сыворотки крови (или плазму), сгусток крови, ликвор. Ликвор берется в стационаре в количестве 2-3 мл в сухую стерильную пробирку. В случае летального исхода с давностью болезни не более 7 дней исследуется секционный материал: головной мозг, спинной мозг из грудного и шейного отделов по 1 см.куб. Исследуемый материал иссекают из органа стерильными инструментами и помещают в стерильную стеклянную посуду. Вскрытие трупа необходимо провести в возможно ранние сроки после смерти больного, желательно в день смерти. До вскрытия труп хранить при низкой температуре. Доставляется материал для исследования в лабораторию в день отбора проб в термоконтейнере со льдом. Если нет возможности доставить в этот же день, то материал замораживают и хранят в морозильнике.

При вирусологических исследованиях проводят реакцию нейтрализации на новорожденных мышах или культуре клеток с гомологичной иммунной сывороткой.

В культуральной жидкости инфицированных клеточных культур и мозга мышей антиген вируса клещевого энцефалита выявляется с помощью прямого или непрямого метода флуоресцирующих антител (МФА), по цитопатогенному действию (ЦПД), с помощью феномена бляшкообразования, в результате выявления специфических антигенов в реакции подавления гемагглютинации (РПГА), реакции диффузной преципитации в агаре (РДПА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Прямой и непрямой методы флюоресцирующих антител позволяют осуществлять экспресс-индикацию вируса клещевого энцефалита в инфицированных клеточных культурах.

Высоко чувствительной и специфичной является реакция непрямой гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом. Её достоинством также является то, что она технически проста. РНГА позволяет обнаружить наличие вируса непосредственно в исследуемом материале, не прибегая к его предварительному накоплению. Принцип РНГА заключается в том, что происходит взаимодействие антител, адсорбированных на поверхности эритроцитов, с гомологичным антигеном, в результате чего происходит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов.

Целью серологических методов исследования является обнаружение в крови антител к вирусу клещевого энцефалита. Первыми появляются специфические иммуноглобулины класса М, которые затем постепенно заменяются иммуноглобулинами класса G. Обнаружение в крови человека Ig M всегда свидетельствует о наличии острого инфекционного процесса.

Максимальный титр тормозящих гемагглютинацию антител определяется на 2-3 неделе от начала заболевания, но в отдельных случаях их формирование несколько замедляется и они появляются на 6-7 неделе. Обычно эти антитела определяются в крови реконвалесцентов в течение нескольких лет. Комплементсвязывающие антитела редко появляются на 1 неделе от начала заболевания, а наивысшая их концентрация определяется на 6-8 неделе. Сохраняются они в крови переболевших не так долго: у 40% уже через год титры не определяются, у остальных могут быть выявлены в течение разного срока, вплоть до нескольких лет. Вируснейтрализующие антитела появляются на 2 неделе, титр их повышается на протяжении 3-4 недель и затем сохраняется в течение многих лет жизни переболевшего. При определении антител иммуноферментным методом специфические антитела обнаруживают несколько раньше, чем подавляющие гемагглютинацию, и в более высоких разведениях сывороток. При быстром формировании иммунного ответа высокие показатели можно получить уже в начале заболевания. В случаях замедленной продукции антител в иммуноферментном тесте можно выявить антитела при отрицательных показателях РТГА.

Известны случаи заболевания клещевым энцефалитом лиц вакцинированных, а также единичные случаи повторного заболевания. Недостаточная для полного предотвращения заболевания напряженность иммунитета может быть обусловлена свойствами вирусного штамма, количеством вируса, попавшего в организм, временным ослаблением резистентности организма или совокупностью этих факторов. Заболевания на фоне грундиммунитета, как правило, протекают в более лёгкой форме, специфические антитела выявляются уже в первые дни заболевания.

Серологическими методами исследуются парные сыворотки. Первую пробу крови забирают в первые дни болезни, до начала специфического лечения, вторую – на третьей неделе от начала заболевания. В случае отсутствия антител в первых двух пробах и при лечении гаммаглобулином рекомендуется исследовать третью сыворотку через полтора-два месяца. При двух волновом течении клещевого энцефалита целесообразно обследовать пробы крови, взятые во время 1 и 11 волны лихорадочного периода. Для определения состояния иммунитета исследуется единичная сыворотка. Пробу крови необходимо забирать через 4-5 недель после вакцинации или введения гаммаглобулина.

Серологический диагноз основывается на четырехкратном и более увеличении титра специфических антител. Снижение титра в четыре и более раз также считается диагностической сероконверсией. Стабильные титры антител во всех пробах сывороток не являются основанием для подтверждения или исключения диагноза. Необходимо помнить, что жители эндемичных районов могут иметь специфические антитела, сформировавшиеся в процессе естественной иммунизации. Постоянные титры антител могут выявляться у вакцинированных лиц. Отрицательные результаты исследования проб крови в начале заболевания и через 5-6 недель после выздоровления свидетельствуют против клещевого энцефалита.

Для серологических исследований кровь забирают из вены в количестве не менее 5 мл. в сухую стерильную пробирку. Для лучшего образования сгустка пробирку выдерживают в термостате 30 мин. или при комнатной температуре 1-2 ч., затем стерильной петлей отделяют сгусток от стенок пробирки и центрифугируют. Полученную сыворотку переносят в стерильную пробирку, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в лабораторию в термоконтейнере. Нельзя допускать гемолиза эритроцитов. Если нет возможности направить сыворотку в лабораторию в тот же день, то пробирку оставляют в холодильнике при температуре +4С и доставляют через сутки. Если возникает необходимость длительного (несколько недель) хранения материала, его можно сохранять при отрицательных температурах, но при этом нужно иметь в виду, что в результате многократного замораживания и оттаивания происходит снижение титров вируса и антител, что приводит к искажению результатов исследования.

Для обследования больных с подозрением на клещевой энцефалит могут быть использованы многие серологические реакции, но в практической работе используются наиболее доступные и технически простые реакции: РТГА, РСК, ИФА. В основе реакции торможения гемагглютинации лежит способность антител подавлять вызываемую вирусами гемагглютинацию, что связано с блокировкой специфических антигенов поверхностной оболочки вирионов. Вирус клещевого энцефалита агглютинирует эритроциты гуся. Принцип реакции связывания комлемента (РСК) состоит в том, что образование комплекса антиген-антитело происходит в присутствии комплемента. Индикатором наличия комплемента в свободном состоянии служит гемолитическая система, состоящая из антител, лизирующих эритроциты, и эритроцитов. В основе иммуноферментного метода лежит принцип сорбции на твердой фазе антител или антигенов и специфических антител, меченых ферментом. В настоящее время промышленность выпускает иммуноферментные тест-системы для определения антител класса М и G.

При оценке результатов лабораторного исследования на клещевой энцефалит необходимо принимать во внимание следующее: сроки отбора проб, особенности клинического течения заболевания, особенности иммунитета пациента, метод, которым проводилось лабораторное исследование проб.

Все пробы, поступающие в лабораторию для вирусологического и серологического исследования должны быть промаркированы, иметь четко заполненные сопроводительные документы. В сопроводительных документах должна содержаться необходимая характеристика материала, цель исследования, сведения о больном, данные о времени и месте сбора образцов.