Дыхание бактерий. Методы создания анаэробных условий.
В процессе обмена в-в мкÒ постоянно нуждаются в притоке энергии. Она освобождается при ок-ии пит в-в и в виде АТФ исп-ся клеткой. Сущность ок-я закл-ся в переносе электронов и протонов от донора к акцептору. У мкÒ чаще происходит отщепление 2 атомов Н (дегидрирование) от акцептора при участии ДГ. Биол ок-е может проходить как при участии О2, так и без него. По отношению к О2 выделяют следующие группы мкÒ:
1) ОБЛИГАТНЫЕ АЭРОБЫ. Способны плч энергию путём дыхания. Причём обязательно нуждаются в О2, который используют в качестве конечного акцептора водорода.
2) ОБЛИГАТНЫЕ АНАЭРОБЫ. Процессы биол ок-я протекают у них по типу брожения, а расти и размножаться они могут только в бескислородных условиях, в присутствии О2 гибнут. Конечным акцептором водорода являются орг соед-я – чаще всего восстанавливается ПВК.
3) ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ АНАЭРОБЫ. Могут расти и размножаться и в присутствии и в отсутствии О2, т.к. их ферментная система способна переключаться с одного типа дыхания на другой.
4) МИКРОАЭРОФИЛЫ. Лучше растут при низком содержании О2 и повышенном СО2 («капнофильные мкÒ»).
5) АЭРОТОЛЕРАНТНЫЕ. Могут выживать в присутствии атмосферного кислорода, но не могут использовать его в качестве конечного акцептора водорода (например, молочнокислые бактерии – бродильный метаболизм).
Т.о, факультативные анаэробы выращивают при пониженном содержании кислорода, облигатные – при полном его отсутствии, что достигается путем посева материалов внутрь жидкой или полутвердой питательной среды.
Условия культивирования. Наиболее пригодной для выращивания бактерий–анаэробов является среда Китта–Тароцци (среда обогащения), состоящая из концентрированного МПБ, глюкозы и агара. На дно пробирки для адсорбции кислорода помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1,0–1,5 см и заливают 6–7 мл среды. Перед посевом среду кипятят 10–15 мин для удаления воздуха, затем быстро охлаждают, а после посева заливают стерильным вазелиновым маслом. Материал, содержащий спороносные анаэробы, высевают в две пробирки со средой Китта–Тароцци, одну из них прогревают 30 мин при температуре 80°С для уничтожения вегетативных форм сопутствующей микрофлоры.
Посевы на поверхности плотных сред, разлитых в чашки Петри, культивируют в макро– или микроанаэростате.
Макроанаэростат представляет собой двухстенный аппарат с крышкой. Между стенками аппарата находится вода, источником тепла служит электричество, терморегулятор обеспечивает постоянную температуру. Посевы помещают в анаэростат после того, как температура в нем будет доведена до 37°С, и герметически закрывают крышкой. Анаэростат соединяют с вакуум–насосом и, выкачивая воздух, создают вакуум 3–5 мм. Посевы инкубируют в анаэростате обычно в течение 48 ч. Имеются также портативные анаэростаты. Это небольшие металлические цилиндры с герметически закрывающейся крышкой, постоянная температура в которых создается при помещении их в термостат.
Особенности выделения бактерий–анаэробов. В первый день исследуемый материал микроскопируют и высевают в среду Китта–Тароцци градуированной или пастеровской пипеткой, прогревают при температуре 80°С в течение 30 мин, заливают вазелиновым маслом и посевы помещают в термостат. На второй день помутневшую (нередко вспенившуюся) среду обогащения набирают пастеровской пипеткой, которую опускают через слой вазелинового масла до дна пробирки.
Выделенную культуру микроскопируют и пересевают на плотные питательные среды. Изолированные колонии получают последовательным засевом шпателем бульонной культуры в три чашки Петри с кровяно–сахарным агаром. Чашки Петри помещают в анаэростат при температуре 37°С на 24–48 ч или культуру засевают в столбики расплавленных и остуженных сахарных агаров после предварительного разведения в изотоническом растворе натрия хлорида. На третьи сутки изучают выросшие на чашках Петри колонии (или извлекают колонии из столбиков агара), делают из них мазки, высевают на среду Китта–Тароцци для обогащения чистой культуры.
Чтобы установить видовую принадлежность выделенной культуры бактерий, кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей, необходимо определить на ряде Гисса их ферментативные свойства.
Т.о, используют следующие методы получения анаэробных условий:
1) ФИЗИЧЕСКИЙ (анаэростат)
2) ХИМИЧЕСКИЙ (оксикатор, сорбент – пирогаллол)
3) БИОЛОГИЧЕСКИЙ
– Метод ФОРТНЕРА – чашку петри пополам, заливают парафином
– Метод ЧАСОВЫХ СТЁКОЛ – выпуклое засевают аэробами.
4) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦ ПИТ СРЕД
– уколом в среду ВИЛЬСОН–БЛЕРА (колонии чёрные)
– в стеклянной трубке.
Питание бактерий. Клсф питательных сред, их состав.
МкÒ используют пит в-ва для построение компонентов б!# и для плч энергии. По х-ру захвата пищи б! относятся к ОСМОФИЛАМ, т.е. питаются веществами, растворёнными в воде. Как и др мкÒ они нуждаются в большом кол-ве минеральных в-в (С, О, N, S, Р, Са, Fe и др).
Основным источником С для б! могут служить неорг соед-я (чаще СО2), из к/х мкÒ синтезирует орг в-ва – это АУТО- или ФОТОТРОФЫ (синегнойная палочка). Если же мкÒ нуждаются в орг соед-ях, к/е служат им источником С и эн, то их наз ХЕМО- или ГЕТЕРОТРОФАМИ. В рез ассимиляции и ок-я орг в-в (из прир соед-й чаще всего исп-ся ПС – крахмал, целлюлоза), выделяется эн.
Помимо этих в-в, мкÒ необходимы доп в-ва – факторы роста, к ним относится большое кол-во АК, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины. Они входят в состав микробной #, но синтезировать их самостоятельно они не могут, поэтому факторы роста обязательно должны присутствовать в пит среде у некоторых б!!. Если мкÒ нуждаются в факторах роста – АУКСОТРОФЫ, если нет – ПРОТОТРОФЫ.
Источником N и S для мкÒ служат сульфаты, нитраты, карбонаты и др, к/е восстанавливаются до H2S и N2. Самый распространённый источник N –аммонийные соли (восстанавливаются до N2); т/же АК. Источником S явл H2S (в прир усл из него восст-ся S с участием Beggiatoa) и АК, содержащие S.
Осн преградой на пути пит в-в явл # мбна. Ч/з неё могут переноситься только те в-ва, для к/х есть спец транспортная система. Существует несколько типов транспорта веществ:
1) ПРОСТ ДИФФУЗИЯ – неспецифич проникновение в-в в #, зависит от размеров и липофильности молеклы.
2) ОБЛЕГЧЁННАЯ ДИФ-Я – по градиенту конц (без затрат эн) с помощью ферментов СУБСТРАТСПЕЦИФИЧНЫХ ПЕРМЕАЗ или ТРАНСЛОКАЗ.
3) АКТИВНЫЙ ТРАНСПОРТ – с затратой энергии и при участии спец ферментов, против градиента конц.
4) ТРАНСЛОКАЦИЯ ГРУПП – происходит перенос и трансформация молекулы: глюкоза → глюкозо-6-фосфат.
КЛСФ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД:
1) По консистенции:
– Жидкие (МПБ, желчный и сахарный бульоны, пептонная вода …)
– Полужидкие (полужидкий агар…)
– Плотные (МПА, свёрнутая сыворотка крови …)
– Сухие (Левина, Плоскирева…)
2) По происхождению:
– Искусственные: а) животные (МПА, МПБ, МПЖ)
б) растительные (настои сена, отвары злаков, дрожжей, фруктов…)
– Естественные: а) животные (кровь, сыворотка, жёлчь)
б) растительные (кусочки овощей или фруктов)
3) По составу:
– Простые (МПА, МПБ)
– Сложные (кровяные, сахарные, сывороточные питательные среды…)
4) По назначению:
– Среды консервирования (для первичного посева и транспортировки) – предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов: гипертонический р-р, глицериновая смесь…
– Среды обогащения – для накопления опред группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних и неблаг для др видов: селенитовая среда, пептонная щелочная вода, солевой и жёлчный бульоны…)
– Элективные, селективные среды – для отдельных видов, готовятся с учётом биохимических и энергетических потребностей мкÒ. Выделяют кровяные и сывороточные (Борде–Жангу), яичные (Левенштайна–Йенсена, ЖСА…) и др. среды (ЖСА, УКА, Эндо, Плоскирева…).
– ДДС – для изучения и идентификации отдельных групп, видов, типов б!! В основе различные в-ва, при расщеплении к/х происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки, мочевина…) сторону. В них часто вносят индикаторы → визуально оценить изменение рН. Напр, сдвиг в КИСЛУЮ сторону вызывает покраснение индикатора Андреде (в основе фуксин) или пожелтение при использовании бромтимолового синего, а при сдвиге в ЩЕЛОЧНУЮ сторону они не меняют окраски.
Дата добавления: 2015-04-01; просмотров: 2450;