Принцип приготовления питательных сред. Типы сред, используемые для культивирования микроорганизмов. Условия культивирования микроорганизмов.

Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим качеством результаты исследования. В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы органогены: азоты, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды. По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: оДни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка. Источником углерода для патогенных бактерий являются главным образом различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCl, КН2РО4, К2НРО4 и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др. Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды. По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агара или желатина. Агар-агар (по-малайски желе) —продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86° С, застудневает при 36—40° С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37" С дало возможность выращивать патогенных микробов при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин — вещество белковой природы животного происхождения.

В теплой воде при температуре 32—34 С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается и он плохо застывает. Исходные продукты для приготовления питательных сред. Для приготовления питательных сред используют: 1. Продукты животного происхождения (мясо, рыба, ка зеин, молоко, яйца, кровь и т. д.). 2., Продукты растительного происхождения (картофель и др.). 3. Органические и неорганические соединения определенного химического состава. Питательные среды, приготовленные из продуктов растительного и животного происхождения, несмотря на то что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в практике микробиологии.

Синтетические питательные среды, составленные из химических соединений, используют преимущественно для изучения обмена веществ микробной клетки. Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны: 1. Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества. 2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. 3. Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса. 4. Обладать изотоничностью. 5. Быть стерильными, обеспечивая тем самым возмож ность выращивания чистых культур микробов. Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба. К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические. Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначаются. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определенном значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Дифференциально-диагностические питательные среды.

Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом: 1. Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д. 2. Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами. 3. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов. 4. Среды для определения редуцирующей способности микробов. В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка. Сухие питательные среды.

Приготовление питательных •сред — один из наиболее ответственных и трудных участков - работы бактериологической лаборатории. В настоящее время медицинской промышленностью Советского Союза организовано производство консервированных сред. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде. Наряду с обычной средой — мясо-пептонным агаром производится много специальных питательных сред сложного рецептурного состава для выращивания микробов кишечной группы (например, среды Эндо (рец. 79, с. 365), Левина (рец. 80), сухой бактоагар Плоскирева (рец. 81), КУА (рец.ПО, с. 377). Сухие питательные среды поступают в продажу в стеклянных банках с плотно завинчивающимися пластмассовыми крышками, обеспечивающими герметичность. В таком же виде они должны храниться в лаборатории.