Этап БСМИ. Приготовление микропрепаратов.
В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических микропрепаратов:
1) препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в убитом состоянии:
· бактериологический мазок используется наиболее часто.
В пламени горелки прокаливают (фламбируют) бактериальную петлю и верхнюю часть петледержателя (петлю держат в правой руке как писчее перо, левши - наоборот).
1. Пробирку с культурой берут большим и указательным пальцами левой руки. Пробку зажимают мизинцем правой руки и извлекают её из пробирки.
2. Края горлышка пробирки фламбируют в пламени горелки и почти одновременно ещё раз обжигают петлю.
3. Петлю быстро вводят внутрь пробирки, охлаждают и погружают в бульонную культуру или прикасаются к налёту на скошенном питательном агаре.
4. Петлю извлекают, быстро фламбируют край пробирки, пробирку закрывают и ставят в штатив. Петлю стерилизуют: в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную часть пламени горелки, чтобы не произошло разбрызгивание сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Прокаливание в целом занимает 5–7 сек.
5. Приготовление мазка: материал из жидкой питательной среды распределяют по площади диаметром примерно 1 см; материал из плотной питательной среды эмульгируют в капле физиологического раствора. Хорошо приготовленный мазок тонкий, быстро высыхает на воздухе. Мазок можно подсушить над пламенем спиртовки, контролируя температуру рукой.
6. Высушенный мазок фиксируют 3 раза, медленно проводя его в верхней части пламени спиртовки, мазком вверх (физический способ фиксации). При этом происходит денатурация белка бактерий, они закрепляются на предметном стекле, лучше воспринимают анилиновые красители и не смываются при окрашивании.
· мазки из жидкого материала (ликвор, моча) готовят аналогично мазку из жидкой питательной среды;
· мазки из вязкого материала (мокрота, гной) готовят, помещая каплю материала между двумя стёклами и разводя их в противоположных направлениях, получают два мазка;
· тонкий мазок крови: на предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Шлифованное стекло (уже предметного) ставят на первое под углом 450 подводят к капле крови (3–4 мкл) до соприкосновения с ней. После того, как кровь растечётся по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стёклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. После приготовления мазки сушат на воздухе и фиксируют химическим способом: погружением в метанол (5 мин) или этанол (10–15 мин) или смесь Никифорова (10–15 мин). Фиксация цитологического материала позволяет сохранить структуру клеточных элементов, поэтому её следует применять как можно раньше.
Правильно приготовленный мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, т. е. располагаться на 1–1,5 см от краёв, занимать 2/3 длины стекла и заканчиваться «метёлочкой». Толстые, густо-розовые мазки не следует использовать, т. к. в них морфология клеток плохо различима.
Для получения качественных мазков крови следует учитывать следующие моменты:
а) предметные стёкла и стёкла, которыми готовят мазки должны быть безупречно вымыты и обезжирены в смеси Никифорова.
б) кровь с антикоагулянтом может сохраняться при +40С в течение 24 часов без существенных изменений числа и морфологии клеток. Тем не менее, гематологические исследования рекомендуется проводить как можно раньше, так как патологические клетки часто менее устойчивы к хранению. При использовании антикоагулянта, нужно помнить, что несоответствие концентрации антикоагулянта к объёму взятой крови, недостаточно тщательное смешивание могут привести к значительным ошибкам (неточному определению концентрации клеточных элементов, искажению морфологической структуры клеток).
· толстая капля крови: на середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают предметное стекло непосредственно ко второй капле крови, выступающей из пальца (первую удаляют ватой). Нанесённую на стекло кровь бактериальной петлёй распределяют по площади диаметром примерно 1 см; стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания; кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край;
· препарат-отпечаток: вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу последовательно несколько раз;
· препарат-соскоб: поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накалёнными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стёклами; далее поступают, как при приготовлении мазка из вязкого материала. Если ткань органа плотная, из глубины разреза делают скальпелем соскоб; полученный материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлёй;
· препарат для электронной микроскопии: исследуемый материал тончайшим слоем наносят на тонкую плёнку-подложку (вместо предметного стекла), незначительно поглощающую электроны; плёнка крепится на опорную сетку; препарат контрастируют с помощью электронно-плотных (задерживающих электроны) веществ.
2) препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в живом состоянии:
· висячая капля: на середину не обезжиренного покровного стекла помещают каплю бульонной микробной культуры. Каплю покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным переворачивают; капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, поэтому препарат долгое время пригоден для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения, переходят на увеличение х40 или иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму;
· придавленная капля – препарат для микроскопии живых объектов (клеток культуры тканей, бактерий). Ее готовят путём помещения между предметным и покровным стёклами (толщина предметного стекла < 1,2 мм, покровного – < 0,2 мм) капли взвеси исследуемого материала, избегая образования пузырьков воздуха. На предметное стекло наносят каплю материала, покровное стекло ставят на ребро у края капли и опускают постепенно вытесняя воздух, чтобы избежать образования в ней пузырьков воздуха. В правильно приготовленном препарате стёкла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края предметного стекла. Для лучшей видимости неокрашенных микроорганизмов используют темнопольную или фазово-контрастную микроскопию.
Методы окраски мазков бывают двух типов:
1) простые – используется один краситель, чаще водный фуксин (время экспозиции 1–2 мин) или 1% спиртово-водный раствор метиленовой синьки (время экспозиции 3–5 мин). Время экспозиции определяется толщиной мазка: чем он толще, тем время больше. По истечении времени экспозиции краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют.
2) сложные – применяют 2–3 контрастных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микроорганизмы и выявить некоторые особенности их строения или дифференцировать клетки макроорганизма (табл. 2).
Таблица 2
Дата добавления: 2015-02-23; просмотров: 1559;