Приготовление бактериального гаптена

Суточная культура бактерий на пластинках МПА в чашках Петри смывается 4-5 мл 1%-ной уксусной кислоты. Смыв кипятят на водяной бане 30-60 минут, фильтруют через асбестовую вату, фильтрат нейтрализуют 20 %-ным раствором углекислого натрия в присутствии индикатора. Полученный гаптен в количестве 0,5 мл наслаивают на равный объем преципитирующей сыворотки, цельной или разведенной вдвое. На границе между сывороткой и гаптеном появляется кольцо преципитата.

11. Реакция преципитации в агаре.

Реакция преципитации в агаре является одним из наиболее чувст­вительных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости (например, в бактериальных или тканевых экстрактах) и произвести анализ антигенного родства отдельных компонентов в смеси антигенов.

Для постановки реакции используют I %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе. Тщательно профильтрованный полностью прозрачный расплавленный агар разливают в чашки Петри слоем 0,5 см толщиной. После застывания в пластинке агара с помощью металлической трубочки вырезаются луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки и 4-5 по окружности на расстоянии 2 см от центральной. В цент­ральную луночку наливается сыворотка кролика, иммунизированного исследуемым антигеном, а в периферические - раствор исследуемого антигена и сравниваемых с ним веществ. Чашки помещаются в эксикатор с налитой на дно водой (для предупреждения высыхания) при комнатной температуре. Учет результатов реакции производится через 24, 48 и 72 часа.

Антитела из центральной луночки и антигены из периферических диффундируют, навстречу друг другу, и в участках, где создаются эквивалентные концентрации антител и антигенов, выпадает дугообразная полоса преципитации. Появление нескольких полос преципитации между центральной и периферическими луночками указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это ука­зывает на идентичность антигенов, содержащихся в этих луночках. Взаимное пересечение полос преципитации свидетельствует о серологи­ческой неидентичности антигенов.

Реакция кольцепреципитации: 1 – опыт 2 – контроль

Реакция преципитации в агаре

12. Реакция лизиса.

а) Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пастеровс­кой пипеткой каплю гемолитической сыворотки (инактивированной в отношении комплемента), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по I капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки). С помощью бактериальной петли перемешивают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только в опытной капле. Она наступает быстрее при легком покачивании стекла и осторожном подогревании. В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит (так как там отсутствуют антитела);

б) реакция гемолиза. На чистое стекло наносят на расстоянии 1,5 см друг от друга две капли гемолитической сыворотки в разведении 1:300. На таком же расстоянии от второй капли наносят другой пипеткой каплю физиологического раствора. Во все три капли чистой пасте­ровской пипеткой добавляют по I капле 4%-ной взвеси отмытых бара­ньих эритроцитов. После этого в первую и третью капли добавляют по I капле комплемента (свежая сыворотка морской свинки) в разведении 1:10, а во вторую каплю вместо комплемента добавляют физиологичес­кий раствор в том же объеме. После этого содержимое всех капель тщательно перемешивают (перед каждым перемешиванием петля должна быть прокалена и остужена). Для ускорения наступления реакции стек­ла могут быть слегка подогреты высоко над пламенем спиртовки или в термостате 10 минут. Реакция гемолиза происходит только в первой капле, в которой содержатся все необходимые для этого ингредиенты: эритроциты, антитела (сыворотка) и комплемент. Во второй капле про­изойдет реакция агглютинации, так как в ней имеются антиген (эрит­роциты) и антитела (сыворотка), но нет комплемента. В третьей капле (эритроциты + комплемент; никаких видимых изменений не произойдет.