Постановка опыта

Во все пробирки (луночки) разливают физиологический раст­вор: в 1-ю пробирку -0,9 мл, а в остальные - по 0,5 мл. Затем в 1-ю пробирку вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки, перемешивают и пе­реносят 0,5 мл во 2-ю, вновь перемешивают и переносят из 2-й пробирки в 3-ю 0,5 мл и так далее до 7-й пробирки включительно. Из 7-й пробирки 0,5 мл жидкости выливают, 8-я пробирка служит контро­лем и поэтому сыворотки не содержит.

Эритроцитарный диагностикум перед использованием встряхивают до полного исчезновения осадка на дне и получения гомогенной взвеси. По ходу работы встряхивание часто повторяют. Эритроцитарный диагностикум разливают во все пробирки по 0,5 мл. после этого пробирки встряхивают и помещают на 1,5-2 часа в термостат при 37 °С, а затем учитывают результаты реакции (иногда через 16-20 часов).

Учет реакции производят по четырехкрестной схеме:

++++ полная гемагглютинация, эритроциты равномерно устилают почти все дно пробирки, нередко в виде зонтика;

+++ почти все эритроциты агглютинированы и равномерно покры­вают дно пробирки;

++ наряду с равномерным агглютинатом на дне пробирки имеется осадок в виде маленького колечка или "пуговки";

+ большинство эритроцитов осело в центре дна пробирки в виде диска и лишь незначительное количество агглютинировалось с образованием мелких хлопьев;

—признаков агглютинации нет: эритроциты осели в виде маленького колечка или "пуговки" (диска) в центре дна пробирки.

Титром испытуемой сыворотки считается последное ее разведение, которое дает ярко выраженную агглютинацию эритроцитов, не менее чем на +++.

Вариантами использования РПГА являются реакция нейтрализации антигена (рНАг), реакция нейтрализации антител (рНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используются антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаймоконтролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антигенным диагностикумом и рНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (рНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммуннойсывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3-4 часа и окончательно через 18-24 часа. Если в исследуемом материале имеется антиген, то он свяжет антитела (нейтрализует их) и поэтому гемагглютинации не произойдет.

По такому же принципу ставится реакция нейтрализации антигена (рНАг). Только в этом случае в исследуемом материале содержатся искомые антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т.е. произойдет нейтрализация антигена антителами и гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диагностикума не произойдет.

9. Одним из вариантов пассивной, т.е. опосредованной клетками-носителями антител, реакции агглютинации является коагглютинация. В основу этой реакции положено уникальное свойство стафилококков, имеющих в составе своей клеточной стенки белок А, связывать молекулы иммуноглобулинов классов Ig G и Ig M. Поскольку белок А взаимодействует с рецептором, который располагается на Fc - фрагменте молекулы антитела, его активные центры остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигена.