Гетерогенные методы иммуноферментного анализа

Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения (однако первый этап имеет решающее значение). Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии и формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным.

Гетерогенный твердофазный ИФА (ELISA = enzyme linked immunosorbent assay) получил наибольшее распространение в медицинской и лабораторной практике. Для его осуществления обычно применяют 96-луночные полистирольные планшеты, так как на полистироле можно легко адсорбировать антитела, а с помощью специальной обработки и различные антигены.

В случае применения ИФА для поиска антигена (рис. 8) диагностическую систему строят по принципу «сэндвича» (двухцентровый ИФА). Это означает, что для захвата искомого антигена и его детекции используют различные антитела к разным неинтерферирующим детерминантам.

Рисунок 8. Схема твердофазного ИФА для определения антигена

Первые (захватывающие) антитела сорбируют на стенках лунок. Исследуемый материал вносят в лунку, при этом антиген, взаимодействуя с антителами, фиксируется в ней. Лунки тщательно промывают буферным раствором, чтобы удалить не адсорбировавшиеся вещества. Затем вносят вторые (детектирующие) антитела против искомого антигена, меченные ферментом. В качестве фермента-метки обычно используют пероксидазу хрена. После инкубации лунку снова промывают, чтобы удалить несвязавшиеся меченые антитела. На заключительном этапе в лунки вносят хромогенный субстрат (например, орто-фенилендиамин или тетраметилбензидин). Ферментативное расщепление субстрата приводит к образованию окрашенных продуктов реакции.

Таким образом, изменение окраски содержимого лунки будет свидетельствовать о положительном результате реакции. Более того, интенсивность окрашивания характеризует количество антигена (антител) в образце. Измерение окрашивания раствора обычно проводят на ИФА-ридере (планшетном фотометре).

При серодиагностике (рис. 9) используются полистирольные планшеты, на стенках которых заранее с помощью тех или иных методов адсорбируется ("нагружается") антиген. Для предотвращения неспецифического связывания антител с полистиролом оставшаяся свободной поверхность полистирола блокируется (белки молока, бычий сывороточный альбумин).

Рисунок 9. Схема твердофазного ИФА для определения антител

Исследуемая сыворотка вносится в лунку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к сорбированному антигену. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом (используя антитела против иммуноглобулинов различных классов, можно получить ценную информацию о характере иммунного ответа). Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то они на данном этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченые антитела. Добавление после промывки хромогенного субстрата позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в лунках.

Конкурентный твердофазный ИФА низкомолекулярных антигенов может быть реализован по следующей схеме (рис. 10). К иммобилизованным на носителе антителам добавляют материал, содержащий анализируемый антиген и определенное количество антигена, меченного ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

Рисунок 10. Схема конкурентного твердофазного ИФА для определения антигена