Различают прямую и косвенную ДНК-диагностику моногенных наследственных болезней.

При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. В ДНК-диагностике в настоящее время используются разнообразные прямые методы. Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов ДНК, которые выявляются при электрофоретическом анализе. Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и инверсий в исследуемых генах используют методы, при помощи которых можно проанализировать уникальную последовательность ДНК. Примером может служить метод секвенирования - определение нуклеотидной последовательности ДНК. Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямогосеквенирования мутантной ДНК. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, этот метод с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Главное преимущество прямых методов диагностики - почти 100 % эффективность.

Основной недостаток прямых методов состоит в том, что для их применения требуется знание точной локализации патологического гена в геноме, его экзон-интронной структуры и спектра его мутаций. Такая информация на сегодняшний день доступна далеко не для всех моногенных болезней человека.

Косвенное выявление мутаций применяется в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не известна, но имеется представление о положении гена на генетической карте. Косвенная ДНК-диагностика сводится к анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи. Маркеры должны быть расположены в том хромосомном регионе, где и ген болезни. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах. Отличия могут быть по составу нуклеотидов, по числу динуклеотидных повторов. На основе вариабельности маркерных участков ДНК можно дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни. Благодаря анализу полиморфных генетических маркеров можно определить и проследить в поколениях хромосому, несущую патологический ген. Технические приемы в косвенной диагностике те же, что и в прямой диагностике (получение ДНК, электрофорез и другие). Главный недостаток косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа как минимум одного пораженного родственника.

Косвенные методы не требуют знания структуры гена и спектра мутаций в нем. Необходимо только иметь сведения о его локализации. В этом состоит основное преимущество этих методов. Кроме того, методы косвенной диагностики информативны практически для всех обратившихся семей, поскольку всегда есть возможность среди полиморфных маркеров, сцепленных с локусом заболевания, найти информативный для данной семьи.

Методы молекулярной генетики позволяют:

• идентифицировать мутации в гене. Примером выявления мутантного гена является диагностика серповидно-клеточной анемии в эмбриональном периоде. Фрагменты ДНК, полученные при действии рестриктаз у здорового и больного, сравниваются с помощью метода гибридизации по Саузерну, при этом в качестве зонда используется радиоактивно меченая ДНК гена Р-глобина;

• диагностировать моногенное наследственное заболевание путем определения нуклеотидной последовательности генов (гемофилия, гемоглобинопатия) и выявления мутантных генов (фенилкетонурия, муковисцидоз);

• осуществлять генетический анализ полиморфизма ДНК родителей и детей;

• определять индивидуальную изменчивость ДНК человека по вариабельным точкам ДНК, молекулярный анализ которых по-зволяет проводить идентификацию личности человека);

• выделять и синтезировать гены (выделение, синтез и кло-нирование генов является одним из этапов генной инженерии):

а) выделение генов: получение определенных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз: разделение фрагментов по молекулярной массе и электрическому заряду —» определение длины фрагмента —> выявление нуклеотидной последовательности данного гена;

б) синтез генов (варианты): химический синтез — синтез опре-деленных последовательностей нуклеотидов, соответствующих данному гену (используют генетический код и по известной последовательности аминокислот химическим путем синтезируют последовательность ДНК). Ферментативный синтез — с помощью фермента обратной транс - криптазы (ревертазы) на матрице мРНК синтезируют комплементарную ДНК.

Существенно изменились принципы медико-генетического консультирования: благодаря ДНK-диагностике у неврологов появилась возможность раннего выявления носителей мутантного гена и в ряде случаев проведения превентивной терапии на пресимптоматической стадии болезни. Более того, проведение пренатальной ДНК-диагностики позволяет в настоящее время достоверно оценивать генетический статус плода п при необходимости рекомендовать прерывание беременности, способствуя профилактике повторных случаен заболевания в отягощенных семьях. Новейшей страницей профилактики наследственной неврологической патологии является разработка методов преимплантациопной ДНК-диагностики.

27.Гибридологический анализ, его использование в генетических исследованиях.

Гибридологический метод – изучение наследования путем гибридизации (скрещивания), то есть объединения двух генетически разных организмов (гамет). Гетерозиготный организм, который получается при этом, называется гибридом, а потомство – гибридным.

Основные принципы гибридологического метода:

1) для скрещивания используются чистосортные (гомозиготные) родительские организмы, которые отличаются между собою за одной или несколькими парами альтернативных признаков;

2) проводится точный количественный учет потомства в отдельности за каждым исследуемым признаком в ряде поколений.

С помощью скрещивания можно установить:

1. доминантен или рецессивен исследуемый признак (и соответствующий ему ген);

2. генотип организма;

3. взаимодействие генов и характер этого взаимодействия;

4. явление сцепления генов;

5. расстояние между генами;

6. сцепление генов с полом.

Сущность гибридологического метода изучения наследственности состоит в том, что о генотипе организма судят по признакам его потомков, полученных при определенных скрещиваниях. Основы этого метода были заложены работами Г. Менделя. Мендель скрещивал между собой сорта гороха, различающиеся теми или иными признаками (формой и окраской семян, окраской цветков, высотой стебля и др.), а затем следил, как наследуются признаки того и другого родителя их потомками в первом, втором и последующих гибридных поколениях. Проделав эту работу на достаточно большом количестве растений, Г.Мендель смог установить очень важные статистические закономерности количественного соотношения гибридных растений, обладающих признаками того и другого исходного сорта.Гибридологический метод нашел широкое применение в науке и практике.

Гибридологический метод не подходит для человека по морально-этическим соображениям, а так же из-за малого количества детей и позднего полового созревания, скрещивать homosapiens в эксперименте не представляется возможным.Поэтому для изучения генетики человека применяют косвенные методы.

Результаты были обобщены Менделем в следующих трех положениях:

· правило единообразия первого гибридного поколения;

· закон расщепления второго гибридного поколения;

· гипотеза чистоты гамет.

Правило единообразия первого поколения:

при скрещивании гомазиготных особей, отличающихся друг от друга по одной паре альтернативных признаков, все потомство в первом поколении единообразно как по фенотипу, так и по генотипу.

Правило расщепления. Второй закон.

При скрещивании однородных гибридов первого поколения между собой (самоопыление или родственное скрещивание) во втором поколении появляются особи как с доминантными, так и с рецессивными признаками, т. е. наблюдается расщепление.

Согласно второму правилу Менделя можно сделать вывод, что:

1) аллельные гены, находясь в гетерозиготном состоянии, не изменяют друг друга;

2) при созревании гамет у гибридов образуется приблизительно равное число гамет с доминантными и рецессивными аллелями;

3) при оплодотворении мужские и женские гаметы, несущие доминантные и рецессивные аллели, свободно комбинируются.

Таким образом, второе правило Менделя формулируется так:при скрещивании двух гетерозиготных особей, т. е. гибридов, анализируемых по одной альтернативной паре признаков, в потомстве наблюдается расщепление по фенотипу в соотношении 3:1 и по генотипу 1:2:1.

Гипотеза «чистоты гамет».

Правило расщепления показывает, что хотя у гетерозигот проявляются лишь доминантные признаки, однако рецессивный ген не утрачен, более того, он не изменился. Следовательно, аллельные гены, находясь в гетерозиготном состоянии, не сливаются, не разбавляются, не изменяют друг друга. При образовании половых клеток в каждую гамету попадает только один ген из аллельной пары.

28.Половой диморфизм у человека, его генетическая и фенотипическая характеристика.

Половой диморфизм характерен для видов, размножающихся половым путем.

Под половым диморфизмом понимают подразделение людей на лиц женского и мужского пола (мужчин и женщин). Наличие в природе полового диморфизма вообще отражает различия в задачах, решаемых в процессе полового размножения мужской и женской особью. У человека с появлением культуры половой диморфизм стал проявляться и в разделении труда, или вернее экологических функций в популяции (добывание пищи, рождение и воспитание потомства, приготовление пищи, постройка жилья и так далее). В силу биологических особенностей мужчина был более приобщен к поддержанию эколого-экономического благополучия семьи и общины. Женщине достался примат воспроизводства популяции, отсюда её ведущая роль в биологическом существовании человека. Лишь в последнее время возникли тенденции стирания социальных (но не биологических) различий между мужчиной и женщиной.

На организменном уровне половой диморфизм проявляется в половых признаках. Выделяют первичные половые признаки и вторичные. К первичным половым признакам относят внутренние половые органы (половые железы (семенники и яичники) вместе с проводящими путями (семяпроводы и яйцепроводы), маткой) и внешние половые органы. Формирование половых морфологических и функциональных половых признаков определяется наличием в кариотипе данной особи в 23 паре хромосом X- или У-хромосомы. Особи, имеющие кариотип ХУ, развиваются по мужскому типу и у них формируются мужские половые признаки. Особи, имеющие кариотип XX, развиваются по женскому типу.

Считается, что половые признаки начинают формироваться на 7 неделе с момента оплодотворения, когда под воздействием генов У-хромосомы ранее не дифференцированная гонада начинает превращаться в яичко. Роль гормонов в этом процессе пока не известна. На 9 неделе в яичке появляются клетки Лейдига, которые с 10 недели начинают продуцировать мужской половой гормон тестостерон. Под действием этого гормона ранее недифференцированные наружные половые органы превращаются в пенис и мошонку.

У женщин дифференцировка яичника и наружных половых органов происходит, по-видимому, не столь бурно. В отсутствие У-хромосомы на 7 неделе ничего не происходит, а на 8 неделе гонада превращается в яичник. Формирование наружных половых органов по женскому типу происходит примерно на 12 неделе, очевидно, без участия гормонов.

Известен ещё один аспект половой дифференцировки, изученный пока только на животных, но существование которого нельзя исключить и у человека. Установлено, что секреция меток Лейдига воздействует не только на половые органы, но и на мозг. Происходит дифференциация структуры гипоталамуса, от которой у всех изученных млекопитающих зависят гормональные и в значительной степени поведенческие половые признаки. Недостаток соответствующего полового гормона или отсутствие в гипоталамусе рецепторов к нему могут привести к формированию морфологических или поведенческих признаков, более характерных для противоположного пола.

Окончательное формирование признаков, характерных для данного вида происходит к концу пубертатного периода. В это время устанавливаются ритмы и уровни секреции половых гормонов – андрогенов (тестостерона) у мужчин и эстрогена и прогестерона у женщин. Под влиянием этих гормонов формируются все вторичные половые признаки.

Из них наиболее важными являются следующие.

· Особенности строения скелета – высокий рост, массивные кости и узкий таз у мужчин, низкий рост, тонкие кости, широкий таз у женщин.

· Мышцы у мужчин развиты сильнее, что обеспечивает большую физическую силу. У женщин мышцы развиты в меньшей степени.

· Половой диморфизм проявляется также в разном характере распределения жировой ткани у мужчин и женщин. У женщин жировая ткань наиболее выражена в области ягодиц, бедер, нижней части живота. В результате этого типичная женская фигура имеет форму груши. Жировая ткань у женщин в норме составляет около 25% от массы тела. У женщин, имеющих слабовыраженную жировую прослойку, значительно чаще наблюдаются бесплодие и невынашивание беременности. Это объясняется некоторыми авторами выработкой в жировой ткани веществ, похожих по действию на гормон второй половины менструального цикла и беременности – прогестерон.

У мужчин жировая ткань обычно откладывается в области верхней части туловища и на животе (по типу «яблока»). Такое отложение связывают с действием мужских половых гормонов.

5. Под действием мужских половых гормонов у мальчиков в пубертатном периоде увеличивается щитовидный хрящ гортани. В результате происходит перестройка голосового аппарата, и голос приобретает низкий тембр (мутация голоса). Так как у женщин нет мужских половых гормонов, у них голос остается высоким.

6. У женщин во время полового созревания под влиянием женских половых гормонов развиваются молочные железы.

7. Половые гормоны определяют структуру волос и характер оволосения у людей. У мужчин волосы более толстые и жесткие, характерен их рост на лице. Кроме того, у мужчин сильнее, чем у женщин выражено оволосение туловища (хотя имеются большие вариации в разных этнических группах). С действием мужских половых гормонов связывают и облысение.

У женщин волосы тоньше, обычно более мягкие, чем у мужчин данной этнической группы. Меньше выражено и оволосение туловища и конечностей.

8. К проявлениям полового диморфизма относятся и особенности роста и развития у мальчиков и девочек, разная продолжительность жизни и другие особенности, о которых уже говорилось в соответствующих разделах (см. Разд. «Закономерности протекания онтогенеза у человека», «Видовая продолжительность жизни человека»)

29.Медико-генетическое консультирование, его задачи, организация.