Методы исследования фагоцитоза in vitro.

На сегодняшний день используют разнообразные методы определения активности и интенсивности фагоцитоза. В основном анализируется способность лейкоцитов поглощать и переваривать микробы для оценки их функциональной активности.

Для приготовления взвеси живых микробов в пробирку или чашку Петри с однодневной культурой микробов наливают небольшое количество физиологического раствора, перемешивают и разведенную культуру микробов пипеткой переносят в химическую пробирку. Разбавляя в дальнейшем физиологическим раствором, доводят содержимое пробирки до степени мутности бактериального стандарта с концентрацией 1 или 2 млрд. микробных тел. в 1 мл. Убитые культуры обычно продаются в запаянных ампулах с этикетками, на которых указана степень разведения. Для изменения концентрации физиологический раствор добавляют точно по расчету. В видалевскую пробирку набирают: 1 капилляр 4% раствора цитрата натрия, 2 капилляра крови,1 капилляр однодневной живой культуры с 1—2 млрд. микробных тел в 1 мл или убитых микробов с концентрацией 4 млрд. тел в 1 мл. Тщательно перемешивают и ставят в термостат при 37° на 1 ч (в течение этого времени термостат открывать нельзя). Затем содержимое пробирки тщательно перемешивают, делают на предметных стеклах очень тонкие мазки, высушивают их на воздухе, фиксируют и красят обычными методами. В окрашенных мазках сосчитывают 100 нейтрофилов. Счет производят по краю мазка с иммерсионной системой. Отмечают процент фагоцитирующих нейтрофилов — показатель фагоцитарной активности и среднее количество микробов в каждом из фагоцитировавших нейтрофилов — фагоцитарный индекс. Для более точной оценки показателей фагоцитоза определяют количество фагоцитированных микробов в 1 мкл крови. Для этого нужно в тот же день дополнительно взять кровь для определения количества лейкоцитов в 1 мкл крови и для подсчета лейкоцитарной формулы.

Для оценки переваривающей активности клеток фагоцитированные микробы при подсчете общего их количества распределяют по интенсивности окрашивания на три группы:

1) интенсивно окрашенные — непереваренные;

2) слабо окрашенные, измененные микробы — частично переваренные и

3) почти полностью разрушенные — переваренные.

Оценка киллинга фагоцитов. Наиболее надежный метод оценки завершенности фагоцитоза - микробиологический, заключающийся в измерении числа бактерий, выживших в лейкоцитах после фагоцитоза.Для постановки метода готовят взвесь лейкоцитов и опсонизированных микроорганизмов в соответствующих соотношениях. Через определенные промежутки времени лейкоциты разрушают, делают посевы на питательный агар и через сутки подсчитывают число выросших колоний. Лейкоциты здоровых доноров убивают до 80% бактерий за 20-30 мин.