Работа 19. Определение активности липаз в процессе прорастания семян

При прорастании семян масличных растений, отличающихся высоким содержанием триглицеридов, отмечается быстрое уменьшение содержания жиров и одновременно увеличивается концентрация сахарозы. Образование углеводов из жиров - многоэтапный процесс, четко разграниченный в пространстве и во времени. С момента начала набухания семян масличных культур первым ферментом, атакующим молекулу жира (триглицерида), является нейтральная липаза. Установлено, например, что в семенах клещевины эта липаза активируется одной из протеиназ, присутствующих в эндосперме.

Липаза ступенчато гидролизует триглицерид до диглицерида, моноглицерида и, наконец, до свободного глицерина и жирных кислот.

Липазы, присутствующие в семенах масличных растений, проявляют активность при различных значения рН. Поэтому иногда употребляют названия нейтральной, кислой и щелочной липазы. Наиболее активными в семенах масличных является кислая и щелочная липазы. Определение их активности основано на учете концентрации жирных кислот, образующихся при действии на чистый препарат какого-либо жира (масла) экстрактом липаз, выделенным из семян разных периодов проращивания.

ХОД РАБОТЫ

Для навески очищенных от кожуры прорастающих семян подсолнечника (по 3 г каждая) помещают в фарфоровые ступки, приливают по 1 мл чистого подсолнечного масла и тщательно растирают в течение 3-4 минут. Затем в одну из ступок приливают 6 мл ацетатного буфера с рН=4,7, а в другую - 5 мл боратного буфера с рН=8,5 и продолжают растирание в течение 2 минут. Затем содержимое ступок количественно переносят в две конические колбы емкостью 100 мл. Ступку и пестик ополаскивают 5 мл воды, сливая промывные воды в соответствующую колбу, добавляют по 5 капель толуола, плотно закрывают пробками и ставят на ротатор, где перемешивают в течение 30 минут. После этого колбы ставят на 20 часов в термостат, нагретый до 30 °С.

Одновременно готовят две контрольные пробы (для каждого рН), с которым проделывают те же операции, что и при исследовании образцов, однако перед помещением контрольных колб в термостат их содержимое кипятят 5-10 минут на электроплитке для инактивации липаз.

Через 20 часов (на следующий день) колбы вынимают из
термостата, приливают в каждую из них по 50 мл смеси
этилового спирта с эфиром в соотношении 4:1, встряхивают и дают несколько минут отстояться. Далее добавляют по 4-5 капель тимолфталеина и содержимое колб титруют 0,1 н спиртовым раствором NaOH. Активность кислых и щелочных липаз выражают в миллилитрах 0,1 н NaOH, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся в результате действия липаз на 1 г семян.

Результаты рассчитывают по формуле:

где АЛ - активность липазы (кислой или щелочной);

а и в - количество 0,1 н NaOH, затраченное на титрование опытного и контрольного образцов, мл;

Т - поправка к титру 0,1 н раствора NaOH;

Н - навеска семян, г.

Заполняют таблицу:

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) семена подсолнечника, отобранные в различные периоды прорастания; 2) ацетатный буфер с рН=4,7; 3) боратный буфер с рН=8,5; 4) подсолнечное масло; 5) 0,1 н спиртовой раствор NaOH; 6) смесь этилового спирта с эфиром (4:1); 7) толуол; 8) 1%-ный спиртовый раствор тимолфталеина; 9) фарфоровые ступки с пестиком; 10) конические колбы на 100 мл; 11) мерные цилиндры на 10 и 50 шт.; 12) ротатор; 13) аналитические весы; 14) термостат; 15) электроплитка.