Определение активности протеаз (по методу Ансона)

Метод определения активности протеаз основан на определении тирозина (или тирозинсодержащих пептидов), освобождающихся при гидролизе раствора стандартного белка (гемоглобина, казеина, альбумина) протеазами (пептидгидролазами). Оставшийся нерасщепленный белок осаждают раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и фильтруют. С фильтратом проводят цветную реакцию с реактивом Фолина и оптическую плотность полученного раствора измеряют при 280 нм на ФЭКе .

ХОД РАБОТЫ. Берут две пробирки. В каждую наливают по 1 мл раствора гемоглобина и по 1,5 мл фосфатно-цитратного буфера рН 2,2. Содержимое перемешивают и пробирки ставят в термостат при 37-38 °С на 5 мин. Одновременно выдерживают в термостате раствор пепсина. После термостатирования в одну пробирку (контрольная) добавляют 5 мл раствора с массовой долей ТХУ 5 % и перемешивают. Затем в обе пробирки приливают по 0,5 мл раствора ацидин-пепсина (или пепсина), предварительно выдержанного в термостате при 37-38 °С, содержимое перемешивают и пробирки помещают в термостат при 37-38 ºС на 30 мин. После инкубации в другую пробирку (опытная) добавляют 5 мл раствора с массовой долей ТХУ 5 % и оставляют ее в термостате на 10-15 мин для осаждения не прореагировавшего белка и фермента. Содержимое опытной и контрольной пробирок фильтруют и в прозрачном фильтрате определяют продукты ферментативного гидролиза – тирозин (или тирозинсодержащие пептиды). ТХУ продукты распада белка не осаждает.

Берут две чистые пробирки и вносят в них соответственно из опытной и контрольной проб по 2 мл фильтрата. Затем в каждую медленно приливают по 5 мл раствора с концентрацией карбоната (или гидроксида) натрия 0,5 моль/л и по 1 мл рабочего (разбавленного 1:2) раствора Фолина. Содержимое перемешивают и пробирки оставляют при комнатной температуре на 20 мин. После этого интенсивность окраски опытной и контрольной проб определяют на ФЭКе с красным светофильтром. Массу тирозина в пробе находят по калибровочному графику.

Протеолитическую активность выражают в мг (или мкмоль) тирозина, освободившегося на 1 мг белка ферментного препарата (или 1 мл ферментного раствора) за 1 мин. При подсчете необходимо помнить, что продолжительность инкубации составила 30 мин.

Принцип определения, порядок работы, результат анализа записывают и делают вывод об активности ферментного препарата.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; фосфатно-цитратный буфер рН 2,2 (196 мл раствора с концентрацией лимонной кислоты 0,1 моль/л смешивают с 4 мл раствора с концентрацией гидрофосфата натрия 0,2 моль/л); растворы с массовыми долями: гемоглобина 1 % (приготовлен на фосфатно-цитратном буфере рН 2,2), ТХУ 5 %, ацидина-пепсина 1 % (4 таблетки препарата растворяют в 100 мл воды) или пепсина 0,1 % в растворе с массовой долей соляной кислоты 0,2 % (4,5 мл концентрированной соляной кислоты разбавить в мерной колбе до 1 л); раствор с концентрацией карбоната натрия (или гидроксида натрия) 0,5 моль/л; раствор тирозина для построения калибровочного графика, содержащий в 1 мл 500 мкмоль (4,53 мг тирозина растворяют в 50 мл раствора с массовой долей соляной кислоты 0,2 %); реактив Фолина, разбавленный в соотношении 1:2. Реактив Фолина готовится следующим образом: 100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в 700 мл дистиллированной воды. К раствору прибавляют 50 мл 85% ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят с обратным холодильником 10 часов, после чего прибавляют 150 г сернокислого лития, 50 мл дистиллированной воды и несколько капель бромной воды. Для удаления избытка брома смесь кипятят без холодильника 15 мин в вытяжном шкафу. После охлаждения раствор доводят дистиллированной водой до 1 литра, фильтруют и хранят в темной склянке. Цвет реактива должен быть желтым. Перед употреблением его разбавляют водой 1:2 (готовят рабочий раствор).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. К какому классу и подклассу ферментов относятся протеазы?

2. Специфичность действия протеаз.

3. Промежуточные и конечные продукты гидролиза белков под действием протеаз.

4. Где протекает гидролиз белков в живых организмах и роль этих процессов.

5. Принцип метода Ансона определения активности протеаз.

6. Последовательность определения активности протеаз по Ансону.

7. Расчет протеолитической активности ферментов по Ансону.