ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОГО АЗОТА МЕТОДОМ КЬЕЛЬДАЛЯ

Из анализируемого материала экстрагируют небелковый азот. Для чего навеску измельченного материала, взятую в соответствии с предыдущей работой, помещают в химический стакан вместимостью 50 мл и заливают 20 мл дистиллированной воды (высушенный материал перед добавлением воды смачивают несколькими каплями этанола). Содержимое размешивают стеклянной палочкой и оставляют ее в стакане до конца экстракции небелкового азота. Стакан ставят на нагретую до 40-50 °С водяную баню и, перемешивая содержимое каждые 10 мин, выдерживают 30 мин. При этом растворимые в воде азотистые соединения переходят в экстракт. Охлаждают до комнатной температуры, приливают равный объем раствора с концентрацией трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 10 %, перемешивают и оставляют на 30-40 мин. ТХУ осаждает из экстракта белки, оставляя в нем небелковые азотистые соединения. Затем фильтруют через плотный беззольный фильтр. Стакан и осадок на фильтре промывают трижды порциями раствора с массовой долей ТХУ 5 %. Затем фильтр вместе с осадком переносят в колбу Кьельдаля, добавляют туда 10 мл концентрированной серной кислоты, 5-7 кристаллов сульфата меди, 4 г сульфата калия или натрия. Одновременно с опытом ставят контроль с теми же реактивами и таким же, как в опыте фильтром, но без исследуемого материала.

Минерализацию, отгонку аммиака, титрование и расчет проводят так же, как в предыдущей работе.

Определение белкового азота в молоке имеет некоторые особенности. Во взвешенный с точностью до 0,0002 г химический стаканчик вместимостью 50 мл вносят 2-4 мл молока и еще раз взвешивают до такой же точности. Оба результата записывают. Приливают 20 мл раствора с концентрацией ТХУ 15 %, перемешивают, выдерживают 30-40 мин и фильтруют через беззольный фильтр. Стакан и осадок на фильтре трижды промывают порциями раствора с концентрацией ТХУ 5 % (раствор ТХУ вначале наливают в стакан и, тщательно ополоснув его, смыв переносят на фильтр, смачивая все его участки). Далее методика работы аналогична описанной выше.

По разности между общим азотом и белковым азотом данного биологического объекта (или пищевого продукта) находят массовую долю небелкового азота, определяемого методом Кьельдаля.

Массовую долю белка в исследуемом материале можно высчитать умножением массовой доли белкового азота на фактор пересчета азота в белок (белковый коэффициент). Последний определяют делением 100 на массовую долю азота в химически чистом белке, выделенном из конкретного биологического материала (молока, сыворотки, крови, мышц, яиц, зерна пшеницы, гороха, клубней картофеля, моркови, ягод и т.д.)

Принцип метода, ход работы и результаты анализа записывают в лабораторный журнал.

Массовые доли азота в белках некоторых биологических объектов и факторы пересчета азота в белок (белковые коэффициенты) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Массовая доля белка в биологических объектах

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С БИУРЕТОВЫМ РЕАКТИВОМ

Метод основан на биуретовой реакции, образующей в щелочной среде окрашенные в фиолетовый цвет комплексы пептидных связей с ионами меди (II). Он известен в двух модификациях: макрометод и микрометод. Макрометод (макроопределение) применяют в случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (1-10 мг/мл); микрометод позволяет определить в 4 мл щелочного раствора 0,1-2 мг белка. На окраску, даваемую белками, оказывают влияние соли аммония, сахароза, глицерин и др. Ниже приведено описание макрометода.

ХОД РАБОТЫ. Исследование начинают с построения калибровочного графика. Для чего готовят стандартный раствор белка (альбумина, глобулина, казеина или другого белка), содержащий 10 мг белка в 1 мл. Из стандартного раствора казеина (или другого белка) готовят в соответствии с табл. 3 ряд растворов белка известной концентрации.

Таблица 3