Выделение белков из биологических объектов

Процесс выделения белков включает следующие операции:

- измельчение биологического материала до однородной (гомогенной) массы (растения, органы и ткани животных, микроорганизмы);

- перевод белков в растворенное состояние (наиболее часто извлечение белков производят при одновременном измельчении биологического объекта);

- осаждение из раствора отдельных фракций (групп) белков;

- выделение индивидуального белка из смеси других белков.

Операции по выделению белков производят при температуре около 5 °С с применением химических реагентов, щадящих нативную конформацию молекулы белка (применение кислот и щелочей, растворов солей тяжелых металлов для экстрагирования белков недопустимо).

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ

Простые белки – протеины, состоят только из остатков α-аминокислот соединенных пептидными связями. Протеины выполняют разные функции в организме: структурную, каталитическую, регуляторную, защитную, сократительную и т. д. Протеины различаются аминокислотным составом и разделены на группы по способности к растворению в различных растворителях.

Альбумины – белки хорошо растворимые в воде и в водных растворах нейтральных солей и сульфата аммония с концентрацией 4-10 % и выпадают в осадок из этих растворов при насыщении их этими же солями и сульфатом аммония. Альбумины содержатся в клетках всех организмов.

Глобулины – не растворимы в воде, хорошо растворимы в водных растворах нейтральных солей и сульфата аммония с концентрацией 4-10 %, выпадают в осадок при полунасыщенииэтих растворов. Глобулины встречаются во всех видах организмов, наиболее распространены в растениях, особенно много их в семенах бобовых.

Проламины – хорошо растворимы в растворе с массовой долей этанола 60-80 % . Эта группа белков найдена только в растениях и только в семенах злаковых.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ИЗ СЕМЯН ЗЛАКОВЫХ И БОБОВЫХ

ВЫДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНОВ. Ход работы. В пробирки вносят по 1 г: в первую – пшеничной или ячменной муки, во вторую – гороховой. В обе наливают по 10 мл воды, перемешивают и ставят в термостат при температуре 37-38 °С на 30 минут, перемешивая содержимое пробирок через каждые 6-10 минут. По истечении указанного времени содержимое пробирок вместе с осадком переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут со скоростью 3000 об/мин или фильтруют через складчатый фильтр. Полученный прозрачный раствор альбуминов сливают в чистые сухие пробирки и используют для проведения биуретовой реакции (см. стр. 20). По интенсивности окраски делают вывод о содержании альбуминов в исследуемых объектах.

Если к 1 мл раствора альбуминов пшеничной или гороховой муки добавить по 4 мл насыщенного раствора хлорида натрия то белки выпадут в осадок, вначале в виде мути медленно оседающей на дно пробирки. Результаты записать в журнал.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЛОБУЛИНОВ. Ход работы. В пробирки вносят по 1 г: в первую – пшеничной или ячменной муки, во вторую – гороховой. В обе наливают по 10 мл раствора хлорида натрия с массовой долей 10 %, перемешивают и ставят в термостат при температуре 37-38 °С на 30 минут, перемешивая содержимое пробирок через каждые 6-10 минут. По истечении указанного времени содержимое пробирок вместе с осадком переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут со скоростью 3000об/мин или фильтруют через складчатый фильтр. Полученный прозрачный раствор глобулинов сливают в чистые сухие пробирки и используют для проведения биуретовой реакции (см. стр. 20). По интенсивности окраски делают вывод о содержании глобулинов в исследуемых объектах.

Если к 1 мл раствора глобулинов пшеничной или гороховой муки добавить по 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия то белки выпадут в осадок, вначале в виде мути медленно оседающей на дно пробирки. Результаты записать в журнал.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОЛАМИНОВ. Ход работы. В пробирки вносят по 1 г: в первую – пшеничной или ячменной муки, во вторую – гороховой. В обе наливают по 10 мл раствора этанола с массовой долей 70 %, перемешивают и ставят в термостат при температуре 37-38 °С на 30 минут, перемешивая содержимое пробирок через каждые 6-10 минут. По истечении указанного времени содержимое пробирок вместе с осадком переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут со скоростью 3000об/мин или фильтруют через складчатый фильтр. Полученный прозрачный раствор проламинов сливают в чистые сухие пробирки и используют для проведения биуретовой реакции (см. стр. 20). По интенсивности окраски делают вывод о содержании проламинов в исследуемых объектах.

Если к 2 мл раствора проламинов пшеничной или гороховой муки добавить по 2 мл воды, то белки выпадут в осадок, раствор мутнеет. Результаты записать в табл. 4. Таблица 4

Содержание простых белков в пшенице и горохе

РЕАКТИВЫ. Растворы с массовыми долями: хлорида натрия 10 %, этанола 70 %, гидроксида натрия 10 %, сульфата меди 1 %, насыщенный раствор хлорида натрия.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Строение простых белков (протеинов).

2. Какие функции выполняют протеины?

3. Какой принцип положен в основу деления протеинов на группы?

4. Общая характеристика альбуминов.

5. Общая характеристика глобулинов.

6. Общая характеристика проламинов.

7. Назовите основные операции выделения простых белков.

8. Значение превращения биологического материала в гомогенную массу.

9. Что происходит с молекулами выделяемого белка во время настаивания в термостате?

10. Какие условия выделения обеспечивают сохранение нативной конформации молекул белка?

11. Выделение, обнаружение и осаждение альбуминов.

12. Выделение, обнаружение и осаждение глобулинов.

13. Выделение, обнаружение и осаждение проламинов.

14. Какие из выделяемых белков содержатся в пшеничной муке и горохе.