Глава 1. Методы исследования в биохимии

Биохимия является и биологической и химической наукой, так как изучает вещества животного, растительного и микробного происхождения с целью познания их строения, свойств и выяснения механизмов функционирования.

Данные о химическом составе организмов, строении мономеров, полимеров, надмолекулярных комплексов, органелл клеток, их структур и функций были получены разнообразными методами неорганической, аналитической, органической химий, химии высокомолекулярных соединений, физиологии и методами разработанными биохимиками.

Среди методов, используемых в биохимии, ключевое значение имеют методы выделения веществ из биологического материала и их очистка с целью получения индивидуальных соединений.

Следует отметить три главные проблемы выделения индивидуальных комплексов из живых организмов, в особенности таких сложных как белки и нуклеиновые кислоты.

Во-первых исследуемый материал – биомасса, из которой предстоит выделить интересующее исследователя вещество – состоит из сотен и тысяч различных соединений. Разделение таких смесей по уровню сложности не имеет себе равных среди других этапов изучения веществ. Это усугубляется еще тем, что многие компоненты этих смесей, выполняя различные биологические функции, построены однотипно и мало различаются по таким свойствам как растворимость и осаждаемость или способность поглощаться определенным типом сорбентов.

Во-вторых, многочисленные исследования выделенного и очищенного вещества (например, белка), ставят в рамки необходимости работать с очень малыми количествами вещества – мг и мкг. Поэтому основными методами исследования являются: - спектрофотометрические, основанные на измерении поглощения видимого или ультрафиолетового света; - радиохимические, основанные на измерении радиоактивности, и люминесцентные, основанные на флюоресценции (био- и хемилюминесценции).

В-третьих, многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Так многие белки, при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды, подвергаются необратимому изменению нативной конформации – денатурации, которая сопровождается потерей биологической активности – инактивацией. Кроме того, в клетках имеются ферменты, способные гидролизовать белки и нуклеиновые кислоты – протеазы и нуклеазы. В неповрежденных клетках эти ферменты сосредоточены главным образом в лизосомах. Однако при разрушении клеток тканей, которое всегда предшествует выделению веществ, лизосомы разрушаются, ферменты выходят, что приводит к быстрому гидролизу биополимеров в биомассе.

Выделение индивидуальных биополимеров является многоступенчатым процессом. На каждом этапе разделения должна получаться фракция, более богатая выделяемым веществом. Такой процесс называют фракционированием.

Для выделения искомого биополимера из раствора можно воспользоваться осаждением, для этого необходимо понизить растворимость этого биополимера. Так, для осаждения белков добавляют к их водным растворам ацетон. На растворимость белков влияет ионная сила раствора. Высокая концентрация соли приводит к высаливанию. При этом концентрация соли, необходимая для осаждения, различна для различных белков. Наиболее широко для высаливания используется сульфат аммония, обладающий высокой растворимостью и даже высокие концентрации этой соли не вызывают денатурирующего действия на белки.

Изменение рН среды для кислых белков в кислую сторону, а для основных – в щелочную приводит их молекулы к изоэлектрической точке. Молекулы лишенные ионной атмосферы сближаются до радиуса действия Ван-дер-Ваальсова притяжения. Иногда это приводит к выпадению белка в осадок. Такой способ выделения называют изоэлектрическим осаждением. Выпавший осадок можно отделить фильтрованием.

На начальных стадиях выделения белков из исходной биомассы или осадков нередко используют экстракцию. Например, для выделения из измельченного биологического материала фракции альбуминов применяют экстракцию дистиллированной водой, фракции глобулинов – экстракцию 5-10 %-ными растворами нейтральных солей (хлорида натрия или сульфата аммония), суммарной фракции липидов – серным эфиром и т.д.

Многие задачи по разделению веществ решаются с помощью сорбции части компонентов смеси на тех или иных сорбентах (гель фосфата кальция, активированный уголь). Заряженные компоненты можно сорбировать на ионитах – сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы.

Разделение может проводиться по размеру частиц с использованием ситового эффекта. Молекулярные сита – это материалы с порами определенного размера. Вещества, молекулы которых меньше размера пор, при пропускании через колонку задерживаются в порах, так как вода, находящаяся там, служит неподвижной фазой для малых частиц. Для больших молекул эти поры недоступны, и они обтекают гранулы, существенно опережая низкомолекулярные компоненты смеси.

Во многих методах разделения применяют различные низкомолекулярные вещества (органические растворители, соли, кислоты, щелочи), создающие нужные значения ионной силы и рН, от которых, на определенном этапе выделения и очистки, требуется избавиться. Для этого используется диализ, основанный на применении мембран, проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ и непроницаемых для биополимеров.Чаще всего для этого используют пленки из целлофана, представляющие собой нитрат целлюлозы, обладающие прочностью и способностью пропускать молекулы воды и гидрофильных низкомолекулярных компонентов.

Для получения индивидуального вещества, из смеси близких по строению веществ, используют зональные методы разделения. Одним из них является хроматография. Используются три группы методов хроматографии: на колонках, на пластинах (тонкослойная) и на бумаге. Вторым зональным методом разделения смесей является электрофорез, основанный на перемещении заряженных частиц в электрическом поле.

Зональное разделение можно проводить с помощью седиментации органелл клеток, биополимеров в центробежном поле в ультрацентрифугах.

Более тонкие методы разделения основаны на использовании специфического (например, иммунного) сродства биополимера к партнеру получили название аффинных методов разделения. Наиболее широко используемый вариант - использование аффинных сорбентов, которые адсорбируют выделяемое вещество из смеси.

После выделения и очистки конкретного вещества используют методы качественного и количественного определения, методы изучения их свойств, структуры и функций.

Изучение структур биополимеров, надмолекулярных комплексов осуществляют методами электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа.

Выяснение химизма обмена веществ проводят на живых организмах, органах, тканях и клетках животных, растений, микробов методами балансовых опытов, меченых атомов (радиоактивных изотопов) и др.