ФИЗИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ 11 страница

Ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию и встречающиеся у одного организма, но различающиеся по своим физико-химическим свойствам (например, по электрофоретической подвижности, следовательно, по молекулярной массе и заряду) называют изоферментами или изозимами. Наличие изоферментов позволяет организмам лучше приспосабливаться к меняющимся условиям внешней среды.

Катализ осуществляется в результате образования фермент-субстратного комплекса, что приводит к сближению реагирующих молекул или созданию напряженных химических связей путем их растягивания. Субстрат должен соответствовать активному центру не только пространственно, но и по распределению зарядов, расположению групп атомов и так далее. Окончательная подгонка происходит лишь в процессе взаимодействия субстрата с ферментом, претерпевающим при этой реакции конформационные изменения. Продукты реакции отделяются от фермента и молекулы фермента регенерируются. Благодаря своей способности регенерироваться, то есть возвращаться к первоначальному состоянию, одна и та же молекула фермента может катализировать большой объем превращений.

Скорость и направленность ферментативных реакций в клетке зависит от количества фермента, температуры и рН. Как всякая химическая реакция, ферментативные реакции зависят от температуры, что принято оценивать величиной температурного коэффициента (Q₁₀), который показывает во сколько раз данный процесс ускоряется при повышении температуры на 10 С^о. Поскольку ферменты являются белками, то повышение температуры свыше 35-40 С^о вызывает их частичную инактивацию, а дальнейшее повышение температуры приводит уже к необратимой денатурации. У каждого фермента имеется свой оптимум рН, при котором лучше всего проявляется его активность. Это связано с тем, что рН влияет на заряд функциональных групп фермента, составляющих его активный центр, а от заряда зависит возможность образования фермент-субстратного комплекса.

Известны следующие механизмы внутриклеточной регуляции функционирования ферментов:

1. Метаболитная регуляция. Она происходит в результате изменения концентрации метаболитов и не затрагивает активность или число ферментных молекул. Различают регуляцию в местах разветвления путей обмена веществ и регуляцию по принципу обратной связи. В первом случае ферменты конкурируют за один и тот же субстрат и выбор пути определяется концентрацией общего для конкурирующих ферментов субстрата и степенью сродства фермента к субстрату. Под обратной связью понимается влияние более позднего члена цепи взаимосвязанных реакций на более ранний.

2. Ферментная регуляция. При этом типе регуляции изменяется активность ферментов. Изменение ферментативной активности может осуществляться несколькими путями: а) Обратимое или необратимое превращение неактивных предшественников ферментов - зимогенов в активные ферменты. Например, b-амилаза инактивирована в запасающих клетках эндосперма семян злаков из-за соединения с запасными белками посредством дисульфидных связей ( -S-S-). К началу прорастания семян из живых клеток алейронового слоя в эндосперм поступают вещества, разрушающие дисульфидные связи. Активированная b-амилаза принимает участие в гидролизе запасного крахмала; б) Изменение активности фермента под влиянием эффекторов. Связываясь с ферментом, эффекторы могут повышать его активность - это положительные эффекторы - активаторы или уменьшать ее - это отрицательные эффекторы - ингибиторы. Эффектор может влиять на активность фермента, взаимодействуя с активным центром (изостерический эффект) или изменяя конформацию ферментной молекулы в результате связывания с ее аллостерическим центром (аллостерический эффект). Изостерический эффект происходит в том случае, когда эффектор и субстрат похожи по своему строению и конкурируют друг с другом за активный центр фермента. Такой тип ингибирования называют конкурентным ингибированием.

3. Генная регуляция. В этом случае изменяется количество ферментных молекул в клетке из-за включения или выключения синтеза ферментов. Регулирующие факторы действуют на ДНК, РНК или рибосомы.

4. Мембранная регуляция. Различают контактную и дистанционную мембранную регуляцию активности ферментов. Контактная регуляция – связывание ферментов с мембранами или их освобождение меняет их активность. Дистанционная мембранная регуляция активности ферментов осуществляется косвенным путем в результате транспорта через мембраны субстратов и коферментов, удаления продуктов реакции, ионных и рН сдвигов в компартментах клетки.

2.4. Поступление воды в клетку

При температуре выше абсолютного нуля все молекулы находятся в постоянном движении. Диффузия - это процесс, ведущий к равномерному распределению молекул газов или растворенного вещества и растворителя благодаря их постоянному движению. Диффузия всегда направлена от большей концентрации вещества к меньшей. Количество вещества J, диффундирующего в единицу времени через воображаемое поперечное сечение, зависит от величины градиента dc/dx(градиент – мера изменения какого-либо параметра с расстоянием или временем) и от природы диффундирующего вещества, влияющего на коэффициент диффузии D. Это 1-й закон диффузии Фика, который описывается следующим уравнением:

J = - D · dc/dx,

так как суммарный поток направлен в сторону области меньшей концентрации, в уравнении стоит знак минус.

Скорость диффузии уменьшается с увеличением ее продолжительности. Проходимое путем диффузии расстояние пропорционально не времени, как при равномерном движении, а ее квадратному корню. Это 2-й закон диффузии Фика:

dc/dt = D · dc²/dx²,

где dc/dt – изменение концентрации вещества во времени.

Диффузия воды через полупроницаемую мембрану называется осмосом. Полупроницаемая мембрана - это мембрана хорошо проницаемая для воды и непроницаемая или плохо проницаемая для растворенных в воде веществ. Осмотическая ячейка - это пространство, окруженное полупроницаемой мембраной и заполненное каким-либо водным раствором. Все клеточные мембраны, в том числе плазмалемма и тонопласт, являются полупроницаемыми мембранами. Вода проходит в клетку через водные поры в плазмалемме, образованные специальными белками аквапоринами.

Внутри осмотической ячейки раствор развивает осмотическое давление p:

p = i · c · R · T,

где с – концентрация раствора в молях, Т - абсолютная температура, R - газовая постоянная 0,082 л · атм/град · моль, i – изотонический коэффициент, равный 1 + a(n-1), где a - степень электролитической диссоциации, n – число ионов, на которые распадается молекула электролита.

Благодаря осмотическому притоку воды в клетку там возникает гидростатическое давление, называемое тургорным. Это давление прижимает цитоплазму к клеточной стенке и растягивает ее. Клеточная стенка имеет ограниченную эластичность и оказывает равное противодавление. Эластическое растяжение ткани благодаря тургорному давлению ее клеток придает твердость не одревесневшим частям растений. Завядающие побеги становятся дряблыми, так как при потере воды тургорное давление падает. Тургорное давление противодействует притоку воды в клетку. Давление, с которым вода осмотически притекает в клетку, равно таким образом, разности между осмотическим давлением p и тургорным давлением P. Эту величину называют сосущей силой S: S = p - P. Вода поступает в клетку из внешнего раствора, если его потенциальное осмотическое давление меньше сосущей силы клетки и, наоборот, вода выходит из клетки в раствор с более высоким потенциальным осмотическим давлением.

При термодинамической трактовке сосущая сила заменяется водным потенциалом y_w. Водный потенциал можно определить как работу, необходимую для того, чтобы поднять потенциал связанной воды до потенциала чистой, то есть свободной воды. Термин водный потенциал не совсем точен. Правильнее, но менее употребителен термин разность потенциалов воды, поскольку он определяется разностью между химическими потенциалами воды в системе m_w (например, вакуоле) и чистой воды m_ow при атмосферном давлении. Абсолютные значения m_w и m_ow неизвестны, но их разность можно определить. Она всегда отрицательна. Потенциал воды в растворе, растении, почве и атмосфере меньше 0. Потенциал чистой воды равен 0.

Можно также заменить p и P на потенциалы, а именно на осмотический потенциал y_p (отрицательный) и потенциал давления y_р (как правило, положительный). В таком случае осмотическое уравнение превращается в уравнение потенциала воды:

- y_w = - y_p - y_р ( размерность бар = эрг · см^-3 ·10⁶)

Величину осмотического потенциала можно определить плазмолитическим методом. Плазмолиз - это процесс, обусловленный потерей воды клеткой. Он проявляется в отходе протопласта от клеточной стенки. В отдельных местах цитоплазма может в течение более или менее продолжительного времени сохранять связь с клеточной стенкой, образуя так называемые нити Гехта. Наблюдаются различные формы плазмолиза: выпуклый плазмолиз при небольшой вязкости цитоплазмы и вогнутый плазмолиз при высокой вязкости цитоплазмы (рис. 2.4). При переносе плазмолизированных тканей в гипотонический раствор или чистую воду вода поступает в клетку и происходит деплазмолиз. Количество воды в клетке увеличивается, объем вакуоли возрастает и она прижимает цитоплазму к клеточной стенке. Плазмолитический метод основан на подборе изоосмотического (изотонического) раствора, то есть имеющего осмотический потенциал равный осмотическому потенциалу клетки. Раствор, при котором начался плазмолиз, имеет осмотический потенциал примерно равный осмотическому потенциалу клетки. Зная концентрацию наружного раствора в молях, можно вычислить осмотический потенциал клетки.

Рис. 2.4. Формы плазмолиза.

1 – последовательные этапы плазмолиза в клетках листа мха, 2 – выпуклая форма плазмолиза (колпачковый плазмолиз) в клетке эпидермиса чешуи лука с окрашенной антоцианом вакуолью: а – ядро, б – цитоплазма, в – вакуоль (по Д. А. Сабинину – цит. по С. И. Лебедеву).

Иногда при сильном завядании протопласт не отстает от клеточной стенки как при плазмолизе, а сжимается и тянет ее за собой. При этом клеточная стенка прогибается. Это явление называют циторризом. Развивается натяжение или отрицательное давление стенки и потенциал тургорного давления приобретает отрицательное значение. В этом случае величина водного потенциала определяется уже не разностью, а суммой осмотического потенциала и потенциала давления: -y_w = -y_p + y_p.

Величина осмотического потенциала позволяет судить о способности растения поглощать воду из почвы и удерживать ее, несмотря на иссушающее действие атмосферы. Осмотический потенциал колеблется у разных растений в пределах от -5 до -200 бар. У водных растений осмотический потенциал около -1 бара. У большинства растений средней полосы осмотический потенциал колеблется от -5 до -30 бар, растения степей и пустынь имеют более отрицательный осмотический потенциал. Осмотический потенциал различен и у разных жизненных форм. У деревьев он более отрицателен, чем у кустарников и травянистых растений, соответственно. У светолюбивых растений осмотический потенциал более отрицателен, чем у теневыносливых растений.

Поступление воды в клетку обусловлено не только осмотическим давлением, но и силой набухания. Набуханием называют поглощение жидкости или пара высокомолекулярным веществом (набухающим телом), сопровождаемое увеличением объема. Явление набухания обусловлено коллоидальными и капиллярными эффектами. В протоплазме преобладает набухание на коллоидальной основе (гидратация коллоидов), а в клеточной стенке наблюдаются оба эффекта: капиллярный - накопление воды между микрофибриллами и в межмицеллярных пространствах и коллоидальный - гидратация полисахаридов, особенно гемицеллюлоз.

У некоторых частей растений поглощение воды происходит исключительно путем набухания, например, у семян. Вода диффундирует в набухающее тело. Благодаря большому сродству набухающего тела к воде при набухании может возникать давление набухания в несколько сотен атмосфер. Силу набухания обозначают термином матричный потенциал y_t.

Таким образом, для клетки характерны следующие уравнения водного потенциала:

вакуоль: -y_w = -y_p - y_p

протоплазма: -y_w = -y_p - y_p - y_t

клеточная стенка: -y_w = - y_t

Вода в клетку может поступать также в процессе пиноцитоза, когда часть плазмалеммы под влиянием различных причин, чаще всего в результате адсорбции на плазмалемме крупных молекул и вирусных частиц, прогибается внутрь клетки, внешние края такой инвагинации смыкаются и виде пузырька - везикулы с адсорбированной частицей и внешним раствором проходит внутрь цитоплазмы.

2.5. Поступление ионов в клетку

Все неорганические питательные вещества поглощаются в форме ионов, содержащихся в водных растворах. Поглощение ионов клеткой начинается с их взаимодействия с клеточной стенкой. Ионы могут частично локализоваться в межмицеллярных и межфибриллярных промежутках клеточной стенки, частично связываться и фиксироваться в клеточной стенке электрическими зарядами.

Поступившие ионы легко вымываются. Объем клетки, доступный для свободной диффузии ионов, получил название свободного пространства. Свободное пространство включает межклетники, клеточные стенки и промежутки, которые могут возникать между клеточной стенкой и плазмалеммой. Иногда его называют кажущееся свободное пространство (КСП). Термин “кажущееся” означает, что его объем зависит от объекта и природы растворенного вещества. КСП занимает в растительных тканях 5-10 % объема. Свободное пространство всего растения получило название апопласт, в отличие от симпласта - совокупности протопластов всех клеток.

Поглощение и выделение веществ в КСП - физико-химический пассивный процесс, не зависимый от температуры и ингибиторов энергетического и белкового обменов. Клеточная стенка обладает свойствами ионообменника, так как в ней адсорбированы ионы Н⁺ и НCO^-₃, обменивающиеся в эквивалентных количествах на ионы внешнего раствора. В клеточную стенку входят амфотерные белковые соединения, заряд которых меняется при изменение рН. Поэтому адсорбция ионов зависит от величины рН. Из-за преобладания отрицательных фиксированных зарядов в клеточной стенке происходит первичное концентрирование катионов (особенно двух- и трехвалентных).

Для того, чтобы проникнуть в цитоплазму и включиться в обмен веществ, ионы должны пройти через плазмалемму. Транспорт ионов через мембрану может быть пассивным и активным. Пассивное поглощение не требует затрат энергии и осуществляется путем диффузии по градиенту концентрации вещества, для которого плазмалемма проницаема. Пассивное передвижение ионов определяется не только химическим потенциалом m, как это имеет место при диффузии незаряженных частиц, но и электрическим потенциалом e. Оба потенциала объединяют в виде электрохимического потенциала `m: `m = m + nFe, где m - химический, e - электрический, `m - электрохимический потенциалы, n - валентность иона, F - константа Фарадея. Любая разность электрических потенциалов, которая возникает на мембранах, вызывает соответствующее перемещение ионов.

Электрический потенциал на мембране - трансмембранный потенциал может возникнуть по следующим причинам: 1) если поступление ионов идет по градиенту концентрации, но благодаря разной проницаемости мембраны с большей скоростью поступают катионы, чем анионы. В силу этого на мембране возникает разность электрических потенциалов, что приводит к диффузии противоположно заряженного иона; 2) при наличии на внутренней стороне мембраны белков, фиксирующих определенные ионы. За счет фиксированных зарядов создается дополнительная возможность поступления ионов противоположного заряда; 3) в результате активного транспорта либо катиона, либо аниона, в этом случае противоположно заряженный ион может передвигаться пассивно по градиенту электрического потенциала.

Активный транспорт - это транспорт, идущий против электрохимического градиента с затратой энергии, выделяющейся в процессе метаболизма. В определенных пределах с повышением температуры скорость активного поглощения веществ возрастает. В отсутствие кислорода, в атмосфере азота поступление ионов резко тормозится. Под влиянием дыхательных ядов, таких как цианистый калий, окись углерода, и ингибиторов дыхания, таких как 2,4-динитрофенол, азид натрия, транспорт ионов ингибируется. С другой стороны, увеличение содержания АТФ усиливает процесс поглощения.

Опыты, проведенные на искусственных липидных мембранах, показали, что перенос ионов может происходить под влиянием некоторых антибиотиков - ионофоров, вырабатываемых бактериями и грибами. В одних случаях катион входит во внутреннюю полость молекулы ионофора. Образованный комплекс диффундирует через мембрану во много раз быстрее по сравнению со свободным ионом. Ионофоры другого типа взаимодействуют с мембранами, образуя в них поры.

Активный транспорт ионов через мембрану осуществляется с помощью переносчиков. Ион реагирует со своим переносчиком на поверхности плазмалеммы. Комплекс переносчика с ионом подвижен в самой мембране и передвигается к ее внутренней стороне. Здесь комплекс распадается и ион освобождается во внутреннюю среду, а переносчик передвигается к внешней стороне мембраны. Подтверждением наличия переносчиков служит тот факт, что при увеличении концентрации солей в окружающем растворе скорость поступления солей сначала возрастает, а затем остается постоянной. Это объясняется ограниченным числом переносчиков. Переносчики специфичны, то есть участвуют в переносе только определенных ионов и, тем самым, обеспечивают избирательность поступления.

Транспорт с участием переносчиков может идти по градиенту электрохимического потенциала. Это пассивный транспорт, но благодаря переносчикам он идет с большей скоростью, чем обычная диффузия и этот процесс носит название облегченной диффузии.

Активный транспорт ионов идет с потреблением энергии, аккумулированной в АТФ. Для использования энергии АТФ должна быть гидролизована: АТФ + НОН ® АДФ + Ф_н. Этот процесс катализируется ферментом аденозинтрифосфатазой (АТФазой). АТФаза обнаружена в мембранах различных клеток. Транспортные АТФазы являются высокомолекулярными липопротеидами с мол. массой 200 - 700 кД. Для растений большое значение имеет Н⁺-АТФаза (водородный насос или водородная помпа), которая осуществляет перенос протонов через мембраны, используя энергию гидролиза АТФ. Н⁺-АТФаза - это одиночный полипептид с массой несколько большей 100 кД. Его содержание в плазмалемме растительных клеток достигает 15 % от общего количества белка. Перенос ионов водорода сопровождается переносом катионов в обратном направлении. Такой процесс называется антипорт. Вместе с протоном могут двигаться анионы - симпорт. Освобождаемая при распаде АТФ энергия используется для изменения конфигурации самой АТФазы, благодаря чему участок фермента, связывающий определенный ион, поворачивается и оказывается по другую сторону мембраны. Также выделены низкомолекулярные транспортные белки пермеазы (10 - 45 кД), лишенные ферментативной активности.

Пройдя через плазмалемму, ионы поступают в цитоплазму, где включаются в метаболизм клетки. Внутриклеточный транспорт ионов осуществляется благодаря движению цитоплазмы и по каналам эндоплазматического ретикулума. Ионы попадают в вакуоль, если цитоплазма и органеллы уже насыщены ими. Для того, чтобы попасть в вакуоль, ионы должны преодолеть еще один барьер - тонопласт. Транспорт ионов через тонопласт совершается также с помощью переносчиков и требует затраты энергии. Переносчики, расположенные в тонопласте, имеют меньшее сродство к ионам и действуют при более высоких концентрациях ионов по сравнению с переносчиками плазмалеммы. В тонопласте была идентифицирована особая Н⁺-АТФаза. Она не тормозится диэтилстильбестролом – ингибитором Н⁺-АТФазы плазмплеммы.