РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Радиоиммунологические методы в настоящее время, вероятно, наи­более широко применяются для количественного определения гормонов и многих других соединений в биологических жидкостях. Как показывает само название, радиоиммунологический метод представляет собой иммунологическое исследование, в котором ис­пользуют меченые гормоны или связывающие их антитела. Более 20 лет назад Berson и Yalow [26] предложили радиоиммунологиче­ский метод определения инсулина. Этот метод основывался на их наблюдении, согласно которому в периферической крови больных диабетом, получавших инсулин, присутствует белок (который, как было показано позднее, является глобулином), связывающий инсулин, меченный ¹³¹I Значение этих данных и последующей раз­работки радиоиммунологического метода определения инсулина подчеркивается присуждением Yalow и Berson нобелевской пре­мии. Вскоре после первых сообщений этих исследователей други­ми лабораториями были разработаны и описаны соответствующие методы для определения других гормонов. В этих методах приме­няются либо антитела, либо сывороточные белки, связывающие определенный гормон или лиганд и несущий радиоактивную мет­ку-гормон, конкурирующий со стандартным гормоном или гормо­ном, присутствующим в биологической пробе.

Термодинамически взаимодействие антигена и антитела можно рассматривать как реакцию псевдопервого порядка, которая схе­матически может быть представлена следующим образом

где Аг — антиген или гормон, at — антитело к антигену или гормону, Аг — радиоактивно меченный антиген или гормон. Kd — константа скорости диссоциации. Ка — константа скорости ассоциации.

Рис.5—1. Кривые доза—реакция, полученные с помощью трех разных методов определения гормонов. а—преобразования данных в системе logit-координат, где N—импульсы, обуслов­ленные неспецифическим связыванием, В_о — максимальное число импульсов свя­занного гормона, когда в инкубационной среде присутствуют только антитела и меченый гормон; б — данные представлены как отношение импульсов связанного гормона (В) к импульсам (F) против логарифма концентрации гормона; в — кривая доза — реакция для определения стероидного гормона в координатах В/Т против дозы гормона, где Т — общее число импульсов.

Реакция антиген—антитело обратима, но скорость диссоциации комплекса антиген—антитело значительно меньше, чем скорость его ассоциации. Количество гормона, связанное с антителом, явля­ется результирующей скоростей ассоциации и диссоциации.

Поскольку в каждую пробирку вносят постоянную концентра­цию антител и меченого гормона, количество импульсов, связан­ных с антителами, должно зависеть от концентрации немеченого гормона, добавляемого в виде стандарта или неизвестной пробы. Чем выше концентрация немеченого гормона, тем меньшим ока­зывается количество импульсов, связанных с антителами, присут­ствующими в системе в фиксированной концентрации. На рис.5—1 приведены различные часто применяющиеся способы графическо­го изображения результатов радиоиммунологических исследований. Верхний график представляет собой кривую доза—реакция в логарифмических координатах, где по оси ординат отложено чис­ло импульсов гормона, связанного с антителами, приведенное к максимальному числу связанных импульсов (Во), когда инкубиру­ются только антитела и меченый гормон (без немеченого). Это по­строение в системе logit-log координат обычно представляет собой прямую линию, что облегчает визуальную интерполяцию количе­ства гормона в неизвестной пробе. С целью получения прямой линии, облегчающей визуальную интерполяцию количества гор­мона в неизвестных пробах, применяют различные способы транс­формации данных. Большинство результатов радиоиммунологиче­ских определений подвергается машинной обработке, позволяю­щей избежать утомительных и длительных расчетов.

Получение высокоочищенных гормонов дало возможность раз­работать чувствительные радиоиммунологические методы для точ­ного измерения низких физиологических уровней циркулирующих гормонов, требующие относительно малых объемов биологических жидкостей. Для чувствительных радиоиммунологических опреде­лений необходимо следующее 1 — высокоочищенный гормон, несущий радиоактивную метку с достаточно высокой удельной активностью, чтобы в каждую про­бирку можно было вносить только «следовые» его количества; 2 — реактивы, используемые в реакции присоединения метки, не должны изменять иммунореактивности гормона в существен­ной степени; 3 — антитела с достаточно высокой чувствительностью (сродст­вом) и специфичностью, чтобы определить низкие физиологиче­ские уровни нужного гормона; 4 — соответствующий препарат сравнения, по отношению к ко­торому можно было бы интерполировать неизвестные концентра­ции гормона в неизвестной пробе. Препарат сравнения и исследуе­мый гормон должны одинаково взаимодействовать с антителами и давать параллельные кривые доза—реакция.

В надежных системах для радиоиммунологического определе­ния концентрация меченого гормона и антител фиксирована. В связи с этим по мере увеличения концентрации немеченого гор­мон уменьшается вероятность связывания меченого гормона с антителами, что обусловливает обратное соотношение между чис­лом молекул меченого гормона, связанных с антителами, и концен­трацией немеченого гормона в реакционной смеси.

В отношении взаимодействия антигена с антителами прини­маются некоторые допущения 1 — присутствующий гормон гомогенен и взаимодействует с антителами с равным сродством независимо от того, содержит он радиоактивную метку или нет; 2 — присутствующие антитела гомогенны и одна молекула ан­титела взаимодействует с одной молекулой гормона; 3 — два разных вида молекул — гормон и антитела — реагиру­ют до тех пор, пока между ними не установится равновесие; 4 — применяется эффективное средство разделения связанного с антителами и свободного гормона, причем методика разделения не нарушает исходного равновесия, достигнутого между гормоном и антителами.

Хотя перечисленные допущения идеализируют ситуацию, но они приблизительно очерчивают условия радиоиммунологических исследований. С помощью соответствующих методов удается опре­делить такие концентрации гормонов, которые обычно не подда­ются определению большинством биологических методов in vivo. Под чувствительностью или наименьшей определимой дозой пони­мают ту концентрацию гормона, которая вызывает значимое изме­нение процента связывания меченого гормона с антителами при сравнении с «пустой» пробой. Чувствительность определения за­висит от сродства гормона к специфическим антителам.