Работа 5. Определение активности ферментов

1. Действие активаторов и ингибиторов на α-амилазу слюны.

В первую пробирку наливают 0,5 мл 1% раствора хлорида натрия, во вторую — 0,5 мл 1% раствора сульфата меди, в третью — 0,5 мл дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют по 1 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 капле разведенной водой слюны (1:5). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, помещают в водяной термостат с температурой 37°С. Через интервалы в 1—2 минуты из пробирок отбирают пробы и проделывают с ними реакцию с раствором йода в йодиде калия. Гидролиз проводят до стадии эритродекстрина. Отмечают время (в минутах) появления эритродекстрина. Делают вывод о действии (активатор, ингибитор) исследованных добавок.

2. Определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту.

Метод основан на установлении предельного разведения раствора α-амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до эритродекстрина. Методом Вольгемута можно пользоваться для приблизительного определения активности α-амилазы в панкреатическом соке, крови, моче и других биологических жидкостях.

1 мл слюны помещают в пробирку, добавляют 9 мл дистиллированной воды и перемешивают. Получается раствор слюны 1:10.

В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую пробирку вносят 1 мл разбавленной в 10 раз слюны и перемешивают путем трехкратного втягивания и выпускания жидкости из пипетки. Затем 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивая содержимое, как указано выше. 1 мл жидкости из второй пробирки переносят в третью и т. д. Из десятой пробирки после перемешивания 1 мл жидкости удаляют.

Во все пробирки, начиная с десятой, добавляют по 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержимое перемешивают. Пробирки помещают в термостат при 37°С на 30 минут.

Через 30 минут пробирки охлаждают и добавляют в каждую по 1 капле раствора йода в йодиде калия. Отмечают пробирку, в которой произошло расщепление крахмала до эритродекстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание. Активность α-амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37°С в течение 30 минут до стадии эритродекстрина.

Пример: если красно-бурая окраска отмечена в четвертой пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз, то 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз раствора крахмала. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при 37°С: 2×160 = 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц α-амилазы по Вольгемуту:

А 37°/30' = 320 ед.

Контрольные вопросы

1. Что такое активаторы и ингибиторы ферментов?

2. Как можно исследовать влияние активаторов и ингибиторов на действие фермента?

3. Фермент ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина – нейромедиатора, выделяющегося в синапсах холинэргических нервов. Продукты его распада – ацетат и холин – не способны действовать как нейромедиаторы. Гидролиз ацетилхолина прерывается калимином – лечебным препаратом, используемым при двигательных нарушениях после травм, параличей, в восстановительном периоде после перенесенного полиомиелита, энцефалита и т.п. Ингибирование ацетилхолинэстеразы отражает следующая схема:

Сравните структурные формулы ингибитора и субстрата. Почему можно предположить, что ингибитор связывается в активном центре фермента? Как при действии калимина изменится проведение нервного импульса (увеличится, уменьшится, не изменится)?