Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации (размножения) ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выявить и размножить интересующий фрагмент ДНК размером от 80 до 3000 пар нуклеотидов (пн).

Исходные компоненты ПЦР:

1. ДНК-матрица (тотальная ДНК);

2. Праймеры (однонитевые синтетические фрагменты ДНК размером 20-30 нуклеотидов), строго комплементарные правой и левой границам интересующего фрагмента ДНК).

3. Нуклеотиды, являющиеся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);

4. Фермент - ДНК-полимераза, катализирующий удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидов к растущей цепи синтезируемой ДНК.

ПЦР–анализ включает 30 циклов амплификации. Каждый цикл состоит из трех стадий:

1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, разрыв водородных связей между комплементарными нуклеотидами). Проходит при температуре 93-95^оС в течение 1 мин.

2. Отжиг (присоединение) праймеров (50-60^оС, 1 мин).
3. Синтез ДНК - достраивание одноцепочечных участков ДНК по принципу комплементарности (72^оС, 1 мин).

К концу ПЦР происходит накопление нужного участка ДНК до 2ⁿ фрагментов, где n-число циклов амплификации. Этого количества достаточно для точной детекции этого фрагмента методом электрофореза.