А-l-катехии лейкоцианидин

Одно из первых химических исследований конденсированных дубильных веществ было проведено И. Берцелиусом в 1827 г. Си­стематические исследования химии конденсированных дубильных веществ были начаты лишь в 20-е годы нашего столетия Фрейден- бергом с сотр. Несмотря на успехи органической химии и химии полимеров, строение конденсированных дубильных веществ до сих пор во многом остается неясным.

На основании модельных опытов Фрейденберг пришел к вы­воду, что образование конденсированных дубильных веществ происходит в результате окислительной конденсации катехинов. При этом пирановое ядро катехиновой молекулы разрывается и С₂-атом соединяется углерод-углеродной связью с Qj-атомом

другой молекулы:

Исследования последнего десятилетия показали, что многие конденсированные дубильные вещества представляют собой смешан­ные полимеры, построенные на основе катехина и лейкоантоциани- дина:

ОН

К числу растений, содержащих конденсированные дубильные вещества, относятся: зверобой, черника, чай китайский.

Чаще всего в растениях встречается смесь гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ с преобладанием соединений той или иной группы (дуб черешчатый, змеевик, кровохлебка, бадан толстолистный, лапчатка прямостоячая и др.).

§ -2. Физико-химические свойства

Дубильные вещества (таниды) имеют среднюю молекулярную массу порядка 1000—5000 (до 20 000) и представляют собой, как правило, аморфные соединения, образующие при растворении в воде
коллоидные растворы. Из органических растворителей таниды растворимы в ацетоне, этиловом спирте, смеси этилового спирта и этилового эфира, отчасти в этиловом эфире, этилацетате, пиридине; нерастворимы в хлороформе, петролейном эфире, бензоле и серо­углероде. Многие дубильные вещества оптически активны; обладают вяжущим вкусом, легко окисляются на воздухе, приобретая более или менее темную окраску.

Катехины — бесцветные кристаллические вещества, хорошо ра­створимые в воде и органических растворителях (спирты, ацетон и т. д.). Они легко окисляются при нагревании и на свету. Окисле­ние катехинов особенно быстро протекает в щелочной среде, а также при действии окислительных ферментов (полифенолоксидаза, перо- ксидаза).

Молекула катехина содержит два асимметричных атома углеро­да (С₂ и С₃), и поэтому каждый из катехинов может быть представ­лен четырьмя изомерами и двумя рацематами. В зависимости от конфигурации кольца В и гидроксильной группы у С₃-атома раз­личают (±)-катехины и (±)-эпикатехины. В растениях катехины встречаются в изомерных формах, соответствующих (+)-катехину и (—)-эпикатехину. Для УФ спектра катехинов характерен основной максимум поглощения в области 270—280 нм.

Лейкоантоцианиды — бесцветные аморфные вещества, окисля­ющиеся легче, чем катехины. Они растворимы в воде, этаноле, ацетоне, хуже в этилацетате, нерастворимы в этиловом эфире. Лейкоантоцианидины содержат три асимметричных атома углеро­да (С«, С₃, С₄), и поэтому каждый из лейкоантоцианидинов может быть представлен восемью изомерами и четырьмя рацематами. В УФ спектре лейкоантоцианидинов имеется максимум поглощения в области 270—280 нм. При нагревании с разбавленными кислотами лейкоантоцианидины превращаются в ярко окрашенные антоцианы.

ОН J»

. Дубильные вещества, как и другие фенольные соединения, обра­зуют окрашенные комплексы с солями тяжелых металлов. Конден­сированные дубильные вещества дают с раствором железоаммо- ниевых квасцов черно-зеленую окраску, гидролизуемые — черно- синюю. Дубильным веществам свойственна также реакция сочета­ния с диазониевыми соединениями, при этом образуются окрашен­ные продукты. Для них характерна реакция с ванилином (в при­сутствии концентрированной НС1 или 70 %-ной H₂S0₄ развивается яркая красная окраска). Кахетины образуют при этой реакции окрашенный продукт следующего строения:

Свободная эллаговая кислота дает красно-фиолетовую окраску при добавлении нескольких кристаллов нитрита натрия и трех-четы- рех капель уксусной кислоты. Для обнаружения связанной элла- говой кислоты (или гексаоксидифеновой) уксусную кислоту заме­няют 0,1 н. серной или соляной кислотой (кармино-красная окрас­ка, переходящая в синюю).

§ 3. Методы выделения и идентификация

Дубильные вещества — это смесь различных полифенолов, име­ющих нередко сложную структуру, и очень лабильных, поэтому выделение и анализ индивидуальных компонентов представляет собой большие трудности.

При выделении из растительного материала получают фрак­ции дубильных веществ. Для этого используют экстракцию ра­стительного материала органическими растворителями: обрабаты­вают сырье петролейным эфиром, бензолом или смесью бензол — хлороформ (1:1) для удаления основной массы хлорофилла, терпе- ноидов и липидов, затем экстрагируют этиловым эфиром, который извлекает некоторые фенольные соединения, в том числе оксикорич- ные кислоты и катехины; после этого проводят экстракцию этила- цетатом, в результате которой в экстракт переходят лейкоантоциа- ны, димерные проантоцианидины, эфиры оксикоричных кислот и др. В завершение растительный материал экстрагируют метило­вым или этиловым спиртом, при этом в раствор переходят многие дубильные вещества и другие фенольные соединения.

Для получения суммы дубильных веществ используются и дру­гие способы: растительное сырье вначале экстрагируют горячей водой, а затем охлажденный водный экстракт обрабатывают после­довательно вышеперечисленными растворителями.

Широко распространено выделение фенольных соединений, в том числе и некоторых компонентов дубильных веществ, осаждени­ем из водных или спирто-водных растворов солями свинца. По­лученные осадки затем обрабатывают разбавленной серной кисло­той.

Суммарные извлечения дубильных веществ разделяют на инди­видуальные компоненты с помощью хроматографических методов.

Для выделения индивидуальных компонентов дубильных ве­ществ (катехинов, лейкоантоцианидинов и др.) используют раз­личные виды хроматографии: 1) адсорбционную хроматографию на колонках целлюлозы, полиамида (иногда вместо полиамида исполь­зуют гольевой порошок); 2) ионообменную — на колонках катио- нита Дауэкс-50 В в Н⁺-форме; 3) распределительную хроматогра­фию на колонках силикагеля; 4) противоточное распределение; 5) гельфильтрацию на колонках Сефадекса Г-50, Г-100 и др.

Идентификация индивидуальных компонентов дубильных ве­ществ основана на хроматографических методах (хроматография на бумаге и тонкослойная), спектральных исследованиях, каче­ственных реакциях и изучении продуктов расщепления.

Хроматограммы дубильных веществ просматривают в УФ свете и отмечают характер флуоресценции зон адсорбции. Некоторые производные катехинов имеют слабую голубую флуоресценцию, усиливающуюся после обработки хроматограмм парами аммиака. Чаще всего для обнаружения катехинов и лейкоантоцианидинов и их производных на хроматограммах используют 1 %-ный ва­нилин в концентрированной НС1. Лейкоантоцианидины можно от­личить от катехинов при выдерживании хроматограммы в парах соляной кислоты с последующим нагреванием при 105 °С в течение 2 мин, при этом лейкоантоцианидины переходят в антоцианидины (розовый, красно-фиолетовый цвет), а катехины остаются бесцвет­ными или желтеют.

Для более детальной идентификации веществ используют так^: же методы УФ, ИК и ПМР спектроскопии.

Для изучения структуры дубильных веществ широко применяют гидролиз (в частности, ферментативный с помощью танназы), ще­лочное расщепление с последующим анализом полученных продук­тов.

§ 4. Качественное определение

Дубильные вещества в растительном сырье определяют качест­венными реакциями, которые можно подразделить на две группы: реакции осаждения и цветные реакции. Для проведения качествен­ных реакций из растительного сырья готовят водное извлечение.

Методики качественного определения. Приготовление извлече­ния. 1 г измельченного растительного сырья заливают 100 мл во­ды. Нагревают на водяной бане 20—30 мин, процеживают через вату и полученное извлечение используют для проведения качест­венных реакций.

1. Качественные реакции извлечения. К 2—3 мл извлечения добавляют по каплям 1 %-ный раствор желати­ны. Появляется муть, исчезающая при добавлении избытка жела­тины.

2. К 2—3 мл извлечения прибавляют несколько капель 1 %-ного хлорида хинина (антипирина). Появляется аморфный осадок.

3. При добавлении к 2—3 мл извлечения 4—5 капель раствора железоаммониевых квасцов в случае гидролизуемых дубильных ве­ществ появляется черно-синее окрашивание или осадок, а конден­сированных — черно-зеленое окрашивание или осадок (эта реакция используется для открытия дубильных веществ в растительном ма­териале).

4. К 10 мл извлечения прибавляют 5 мл смеси (2 мл НС1, раз­веденной в соотношении 1 : 1, и 3 мл 40 %-ного раствора формаль­дегида). Полученную смесь кипятят 30 мин в колбе, снабженной обратным холодильником. При наличии конденсированных дубиль­ных веществ они выпадают в осадок. Осадок отфильтровывают. К 2 мл фильтрата добавляют 10 капель 1 %-ных железоаммониевых квасцов и около 0,2 г кристаллического ацетата свинца, раствор
перемешивают. В случае наличия гидролизуемых дубильных ве­ществ появляется синее или фиолетовое окрашивание (в нейтральной среде).

5. К 2—3 мл извлечения прибавляют по каплям бромную воду (5 г брома в 1 л воды) до того момента, когда в жидкости станет ощущаться запах брома. При наличии конденсированных дубиль­ных веществ сразу образуется осадок.

6. К 1 мл извлечения добавляют 2 мл 10 %-ной уксусной кисло­ты и 1 мл 10 %-ной средней соли ацетата свинца — гидролизуемые дубильные вещества образуют осадок. При на­личии конденсированных дубильных веществ фильтрат окрасится в черно-зеленый цвет от прибавления 5 капель 1 %-ных железоаммо- ниевых квасцов и 0,1 г ацетата свинца.

7. К 2 мл извлечения прибавляют несколь­ко кристаллов NaNOg и 2 капли 0,1 н. НС1. При наличии гидролизуемых дубильных ве­ществ появляется коричневое окрашивание.

Хроматографическое определение (катехи­нов листа чая ТСХ). 0,1 г измельченного сырья (лист чая) заливают 2 мл 95 %-ного этилового спирта и нагревают на водяной бане до кипения, охлаждают, фильтруют.

Полученный этанольный экстракт наносят с помощью капилляра на стартовую линию хроматографической пластинки «Силуфол» (высота столбика жидкости в капилляре 1,5—2 см; диаметр пятна на стартовой линии не более 5 мм). Рядом с исследуемым экстрак­том на стартовую линию наносят в качестве «свидетеля» раствор очищенной суммы кате­хинов листа чая. После высушивания плас­тинку помещают в хроматографическую ка­меру с системой растворителей н-бутанол — уксусная кислота — вода (40 : 12 : 28). Хроматографирование про­водят в течение 1,5 ч (пробег фронта растворителя 10—12 см). Затем хроматограмму высушивают на воздухе и обрабатывают раствором 1 %-ного ванилина в концентрированной НС1. Кате­хины проявляются в виде красно-оранжевых пятен (рис. 24).

§ 5. Количественное определение

В литературе описано около 100 различный способов количест­венного определения дубильных веществ, которые можно подраз­делить на следующие основные группы.

1. Гравиметрические — основаны на количественном осаждении дубильных веществ желатиной, ионами тяжелых металлов или ад­сорбцией гольевым порошком.

2. Титрометрические — на окислительных реакциях, прежде всего с применением перманганата калия (метод ГФ X).

3. Фотоколориметрические — на реакциях с солями окисного жблеЗа, фосфорновольфрамовой кислотой, с реактивом Фолина — Дениса и др.

4. Методы нефелометричеекие, хроматоспектрофотометрические в основном используются в исследованиях.

В СССР и за рубежом стандартным для технических целей яв­ляется гравиметрический метод с применением гольевого порошка [весовой единый метод (ВЕМ)].

В ГФ X входит титрометрический метод Левенталя в модифика­ции А. Л. Курсанова, основанный на способности дубильных ве­ществ быстро окисляться перманганатом калия.

Для количественного определения танина в листьях скумпии и сумаха предложен метод осаждения дубильных веществ сульфа­том цинка с последующим комплексонометрическим титрованием.

Для количественного определения катехинов в листе чая М. Н. Запрометовым разработан фотоколориметрический метод с использованием бумажной хроматографии для разделения кате­хинов и реакции катехинов с 1 %-ным ванилином в концентриро­ванной НС1, в результате которой образуется окрашенный раствор.

Методика количественного определения дубильных веществ (ГФ X). Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья, просеян­ного сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещают в кони­ческую колбу вместимостью 100 мл, заливают 50 мл кипящей воды и нагревают на водяной бане в течение 30 мин при частом перемешивании. Жидкость отстаивают в течение нескольких минут и осторожно процеживают через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на вату. Сырье в колбе повторно извлекают кипящей водой, как указано выше, процежи­вая жидкость в ту же мерную колбу. Извлечение повторяют не­сколько раз до отрицательной реакции на дубильные вещества (проба с раствором железоаммониевых квасцов). Жидкость в мерной колбе охлаждают и объем извлечения доводят водой до метки. 25 мл полученной жидкости помещают в коническую колбу вместимостью 1 л, добавляют 750 мл воды и 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют "при постоянном перемешивании 0,1 н. перманганатом калия до золотисто-желтого окрашивания.

1 мл 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин. Параллельно проводят контрольный опыт, титруя 25 мл индигосульфокислоты в 750 мл воды.

Процентное содержание дубильных веществ определяют по фор­муле

КРУт-100 * mV_a (100—ш)

где V₁ — объем 0,1 н. КМп0₄, пошедшего на титрование, мл; V₂ — объем 0,1 н. КМп0₄, пошедшего на контрольный опыт, мл; К — поправка на титр (по щавелевой кислоте); D — коэффициент пере­счета на танин: для гидролизуемых дубильных веществ равен 0,004157, для конденсированных — 0,00582; V — общий объем экстракта, мл; т — масса навески сырья, г; V₃ — объем экстракта, взятого для титрования, мл.

Методика количественного определения танина в листьях скум­пии и сумаха. Около 1 г сырья, измельченного и просеянного сквозь сито с размером отверстий 1 мм, взвешивают с точностью до 0,0002 г, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 150—250 мл, при­бавляют 30 %-ного этилового спирта, колбу присоединяют к обрат­ному водяному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически смывая частицы сырья со стенок встряхиванием смеси. Затем смесь отстаивают 10—15 мин и жид­кость сливают через стеклянный фильтр (ПОР-160) в мерную колбу вместимостью 200 мл. Извлечение повторяют еще раз указанным способом, предварительно смыв частицы сырья с фильтра 30 %-ным этиловым спиртом. После охлаждения полученного извлечения до­водят объем раствора 30 %-ным этиловым спиртом до метки. Отбирают из мерной колбы 10 мл извлечения, помещают в пробирку для центрифугирования вместимостью 25—50 мл, прибавляют 10 мл реактива осаждения (см. ГОСТ 4564—79). Смесь перемеши­вают палочкой, палочку промывают 5 мл дистиллированной воды, которую присоединяют к основной смеси.. Через 30 мин смесь центрифугируют в течение 5—10 мин с частотой вращения 5—6 тыс. об/мин, жидкость с осадка сливают, а осадок в пробирке взмучивают в 20 мл 0,25 %-ного аммиака той же палочкой, которую затем промывают 5 мл раствора аммиака указанной концентрации, при­соединяя его к центрифугируемой смеси. После центрифугирования промывную жидкость сливают и отбрасывают. Осадок в пробирке растворяют в 3 мл 30 %-ной уксусной кислоты. Раствор количест­венно переносят в колбу вместимостью 250 мл с помощью 80—100 мл дистиллированной воды. Жидкость нейтрализуют 25 мл 5 %-ного гидрокарбоната натрия, прибавляют 0,5 мл ксиленолового оран­жевого и титруют 0,01 М раствором трилона Б до изменения красно- фиолетовой окраски раствора в желтую.

1 мл 0,01 М раствора трилона Б соответствует 0,0013 г танина.

Процентное содержание танина х в пересчете на абсолютно су­хое сырье вычисляют по формуле

_ К/С0.00130- 200- 100. 100* тЮ (100—ю)

где V — расход трилона Б, мл; К — поправка к титру 0,01 М раствора трилона Б; т — масса навески сырья, г; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.

Реактивы и оборудование: калий перманганат 0,1 н.; инди- госульфокислота; этиловый эфир; желатина 1%-ная; квасцы железоаммониевые [аммоний железо (III) сульфат], 1%-ный раствор; НС1 (конц ,0,1 н ); формальде­гид 40%-ный; свинца ацетат (кристал , 10%-ный); бромная вода; уксусная кис­лота 10 и 30%-ная; NaCl, HCI, 0,1 н ; ванилин 1%-ный в конц. НС1; и-бутанол; уксусная кислота (лед.); NaOH (1%-ный); оксид цинка; цинк (метал.); этило­вый спирт 30%-ный (этанол); аммония хлорид; аммиак водный (конц., 0,25%-ный); H₂S0₄ (16%-ная); натрия ацетат; натрия гидрокарбонат 5%-ный; вода (дистил.); трилон Б (0,01 М); ксиленоловый оранжевый 0,1 %-ный; сумма катехинов листа чая.

Колбы плоскодонные вместимостью 100 мл; колбы плоскодонные конические вместимостью 100, 150, 250, 500, 1000 мл; холодильник (обратный) стеклянный лабораторный с нормальным шлифом; колбы мерные вместимостью 200 и 250 мл; микробюретки и пипетки измерительные вместимостью 10, 25 мл; воронки стек­лянные для фильтрования диаметром 5 см; палочки стеклянные; пробирки стек­лянные вместимостью 10 мл; пробирки центрифужные вместимостью 25—50 мл; цилиндры мерные емкостью 1000 мл, 100, 25 и др.; камеры хроматографические для ТСХ; сито с диаметром отверстий 1 мм; кофемолка; весы лабораторные анали­тические; весы ручные; центрифуга лабораторная на 5—6 тыс. об/мин; капилляры стеклянные; вата гигроскопическая; пульверизатор; фотселектроколориметр ФЭК-56М, пластинки «Силуфол»; баня водяная лабораторная; фильтр стеклян­ный ПОР 160.

Вопросы для подготовки