Выделение целевого продукта

Выделение целевого продукта микробиологического биосинтеза – это завершающая стадия биотехнологического процесса. При этом продукты биосинтеза могут, как накапливаться в клетках продуцентов, так и выделяться в культуральтную жидкость.

Этапы выделения целевого продукта микробного биосинтеза:

1. В обоих случаях на первом этапе очистки целевого продуктанеобходимо сначала отделить биомассу микроорганизмов от культуральной жидкости. Так как содержание микроорганизмов в жидкой среде, как правило, очень низкое (в 1 литре содержится 5-10 г сухой биомассы). Для этого используют различные методы:

Флотация – захват биомассы микроорганизмов пузырьками пены и выделение ее из пенной фракции. Этот метод используют, если клетки продуцентов, из-за низкой смачиваемости, накапливаются в верхних слоях ферментера. При этом жидкость предварительно вспенивают, а затем отделяют верхний поверхностный слой, содержащий пузырьки газа с прилипшими к ним клетками. Флотацию используют на первом этапе отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости.

Фильтрация – пропускание суспензии через фильтрующий материал, на котором задерживается биомасса микроорганизмов. Применяют фильтры однократного и многократного использования: барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум-фильтры, фильтр-прессы различных конструкций, мембранные фильтры. Такой способ используют при получении антибиотиков, особенно когда продуцент имеет мицелиальный характер.

Центрифугирование– осаждение взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Этот способ используют для отделения дрожжей или бактерий в производстве кормовой биомассы. Он требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если а) суспензия фильтруется медленно; б) необходимо максимальное отделение биомассы от культуральной жидкости; в) фильтры рассчитаны только на периодическое действие и необходимо наладить непрерывный процесс сепарации.

Коагуляция – добавление в суспензию реагентов, способствующих образованию и осаждению более крупных клеточных агломератов с последующим отделением их от жидкости путем отстаивания.

2. Вторым этапом при получении продуктов, накапливающихся в клетках, является разрушение клеток.

Процесс разрушения клеточной оболочки может осуществляться как физическими методами (размалывание, действие ультразвука, резкое замораживание и оттаивание, избыточное давление и др.), так и химико-ферментативными (биотехнологическими) методами, к которым относятся:

Гидролиз– разрушение клеточных оболочек под действием химических реагентов и температуры.

Ферментолиз - разрушение клеточных оболочек под действием ферментов при повышенной температуре.

Автолиз – разновидность ферментолиза, когда используют собственные ферменты клетки.

Недостатком процесса разрушения, особенно физического, является неизбирательность дезинтегрирующего воздействия.

3. После разрушения клеток выделение целевого продукта из раствора осуществляется методами, общими для внеклеточных и внутриклеточных продуктов:

Экстракция– переход целевого продукта из водной формы в несмешивающуюся с водой органическую жидкость (экстрагент). Наиболее распространено выделение жироподобных веществ жидкими углеводородами (типа бензина), но применяются и многие другие виды экстрагентов (хлороформ, эфир, бутилацетат). Экстракция прямо из твердой фазы (в том числе и биомассы микроорганизмов) называется экстрагированием. Частным случаем является холодовая экстракция (криоэкстракция), когда предполагается выделение продуктов из замороженных образцов, в этом случае используются растворители с низкой температурой кипения, которые при комнатной температуре переходят в газообразное состояние. Криоэкстракция часто используется в комбинации с криоконсервацией клеток.

Осаждение – выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящим его в твердую фазу. Осаждение проводят физическими (нагревание, охлаждение, разбавление или концентрирование раствора) или химическими методами. Так, пенициллин переводят в кристаллический осадок в присутствии соединений калия или натрия. Белки осаждают добавлением сульфата аммония, органических растворителей (этанола, ацетона).

Адсорбция– перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его осаждения (сорбции) на специальных твердых носителях (сорбентах). Хорошим адсорбентом является древесный уголь, глины с развитой пористой поверхностью. Путем адсорбции выделяют антибиотики и витамины.

Ионный обмен– то же, что и адсорбция, но в этом случае в твердую фазу переходят ионы (катионы или анионы), а не целиком молекула целевого продукта.

Отгонка, ректификация – эти методы используют для выделения растворенных в культуральной жидкости легкокипящих продуктов. Пример – этиловый спирт.

Ультрафильтрация, нанофильтрация и обратный осмос применяются для выделения высокомолекулярных соединений (белков, полипептидов, полинуклеотидов). Обратный осмос и нанофильтрация позволяют отделять даже небольшие по размеру молекулы.

Ультрацентрифугирование используют для выделения вирусов, клеточных органелл, высокомолекулярных соединений.

4. Очистка продукта. Очистку продуктов микробного биосинтеза проводят когда получают продукцию с большим количеством примесей.

Очистку проводят как с помощью рассмотренных ранее процессов экстракции, экстрагирования, адсорбции, ионного обмена, ультрафильтрации, обратного осмоса, ректификации и ферментолиза, так и с помощью других процессов:

Хроматография – процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков. При адсорбции они и отделяются от сорбента вместе, а при хроматографии они выходят из сорбента по очереди, что позволяет их разделять и, значит, очищать друг от друга.

Диализ – процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут переходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа очищают вакцины и ферменты от солей и др. примесей.

Кристаллизация. Этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах. Медленное охлаждение позволяет формировать кристаллы из растворов целевых продуктов, причем чистота их обычно очень высока. Таким образом, например, можно получать кристаллы пенициллина.

Можно даже получить еще более чистый продукт, если кристаллы растворить в воде или растворителе, а потом снова кристаллизовать (т.е. провести перекристаллизацию).