В условиях непрерывного культивирования

Благодаря периодической подаче свежей питательной среды и удалению избытка среды с продуктами метаболизма создается возможность поддерживать культуру в фазе экспоненциального роста (рис 3).

При непрерывном культивировании нет смены фаз развития культуры. В таких условиях скорость потока питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать так, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной.

В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время. Скорость роста биомассы при этом характеризуется уравнением:

= (µ-D) X,

где – скорость роста биомассы, ч^-1; µ - удельная скорость роста культуры, ч^-1; D – скорость разведения культуры питательной среды (показывает объем жидкости, сменяемой за 1 ч), дм³/ч; Х – концентрация биомассы, г/м³.

Глубинное выращивание микроорганизмов проводится в строго стерильных условиях, оно применяется для анаэробных и аэробных продуцентов как наиболее перспективный способ, обладающий преимуществами с точки зрения автоматизации, эстетики и научной организации производства. Однако активность получаемых препаратов (ферментов) в большинстве случаев ниже, чем при поверхностном культивировании, что требует дальнейшей интенсификации биосинтеза.

При поверхностном способевыращивания культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды (или на поверхности жидкой среды). Мицелий полностью обволакивает и прочно скрепляет твердые частицы, клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с небольшой высотой слоя.

Схематично технологический процесс поверхностного выращивания микроорганизмов складывается из следующих этапов:

- получение посевного материала;

- приготовление питательных сред;

- стерилизация питательных сред и засев;

- производственное культивирование;

- измельчение и сушка культуры.

1. Получение посевного материала. Посевным материалом может служить культура, выращенная на твердой питательной среде, споровый материал или мицелиальная масса продуцента, выращенная глубинным способом.

Посевную культуру получают выращиванием микроорганизмов во все возрастающем количестве в 3 или 4 этапа:

- исходную музейную культуру продуцента, находящуюся на твердой агаровой среде, пересевают сначала на 1-1,5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку. Выращивание проводят в термостате до обильного спорообразования;

- второй этап осуществляется на той же среде и при тех же условиях, но в колбах, содержащих до 100 г рыхлой среды;

- на третьем этапе условия те же, но выращивание проводят в сосудах на 500 г среды;

- на четвертом этапе выращивание проводят в посевных кюветах, если материал нужен в виде культуры, или отделяют конидии от основной массы мицелия и среды на специальном вибросепараторе, если необходимы споры.

Если посевной материал готовят глубинным способом, выращивание проводят в инокуляторе объемом 8-10 литров на жидкой питательной среде.

Можно продлить срок хранения посевного материала, если спороносящую культуру подсушить до влажности 10-12 %, а мецелиальную массу охладить до 4-6 ºС.

2. Приготовление питательных сред. Основой почти каждой твердой среды являются пшеничные отруби как источник необходимых питательных росто­вых веществ. В увлажненном состоянии отруби создают требуемую структуру среды. Для повышения активности некоторых ферментов к отрубям добавляют свекловичный жом как материал, богатый пектином и целлюлозой, соевый шрот для повышения содержания белков и стимулирования синтеза протеаз, соевую муку или другие, включающие жиры материалы для индукции липаз, пивные отходы, обогащенные крахмалом, для стимулирования биосинтеза амилаз.

Дополнительное введение в отруби растительных отходов - овсяной или рисовой шелухи, соломы, кукурузных кочерыжек и древесных опилок - может улучшить структуру среды, особенно в случае мелких отрубей. Улучшая струк­туру и облегчая доступ воздуха, такие материалы обедняют среду и понижают активность получающихся ферментов. Устранить это влияние можно прибавле­нием источников минерального азота и фосфора, а также материалов, богатых ценными органическими веществами, например, солодовыми ростками, упарен­ным картофельным соком, кукурузным экстрактом др.

3. Стерилизация питательных сред и засев.Питательную среду готовят в специальных емкостях или непосредственно в стерилизаторе (рис. 4).

Рис. 4. Стерилизатор твердой сыпучей среды с мешалками:

1 - кор­пус; 2 - крышка; 3 - задерживающая сетка; 4 - штуцер вывода отработанного воздуха; 5 - штуцер загрузки посевного материала; 6 - люк для загрузки отру­бей; 7 - штуцер ввода воздуха для охлаждения; 8 - торцевая крышка; 9 - люк; 10 - опора; 11 - штуцер выгрузки; 12 - вал мешалки; 13 - нагревательная ру­башка; 14 –лопасти.

Сначала смешивают нужные компоненты, затем их увлажняют, подкисляют соляной ки­слотой для лучшей стерилизации, добавляют минеральные источники азота и фосфора и подают на стерилизацию.

Прогрев сыпучих смесей осуществляют острым паром в цилиндрических аппаратах при постоянном перемешивании. Время выдержки среды при температуре стерилизации (105-140 ºС) больше, чем для жидкостей, так как труднее обеспечить полный прогрев. Обычно для этого требуется 60-90 минут.

После стерилизации среда охлаждается в этом же аппарате продуванием стерильного холодного воздуха или водой, подаваемой в рубашки. После сниже­ния температуры до 38-40°С в аппарат вводят посевную культуру продуцента, при тщательном перемешивании среды.

Большая доза посевного материала уменьшает длительность начальной фазы, но в этом случае, значительное количество субстрата тратится на энерге­тический обмен, возрастает выход СО₂ и Н₂О, медленно синтезируется фермент, соответственно снижается его выход. Поэтому доза посевного материа­ла должна быть минимально возможной, обычно 0,02-0,1% от массы среды. В заводских условиях из-за неполной стерилизации вносят 0,5-1,0 % посевного материала.

Засеянная среда поступает из стерилизатора на специальный стол и раскладывается ровным слоем на простерилизованные кюветы. Обычно эта операция производится вручную и требует сноровки и быстроты, так как нельзя допускать переохлаждения среды ниже 28-30 ºС, чтобы не замедлить начальный рост культуры. Затем заполненные кюветы устанавливают на этажерки, которые сразу же задвигают в растильные камеры.

4. Производственное культивирование. Процесс выращивания поверхностной культуры длится 36-48 часов. Весь цикл роста можно разделить на три периода:

- в течение первых 10-12 часов происходит набухание конидий и их прорастание; в этот момент температура не должна быть ниже 28 ºС;

- в следующие 12-18 часов происходит быстрый рост мицелия, его можно наблюдать в виде пушистого налета серовато-белого цвета. Клетки потребляют основное количество питательных веществ, энергично дышат и выделяют большое количество тепла, которое необходимо отводить;

- третий период продолжается 12-18 часов. Обменные процессы ослабевают, тепла выделяется меньше, но образование фермента все еще происходит.

Более современный способ выращивание поверхностной культуры, в отличие от выращивания ее в кюветах, это выращивание продуцентов в вертикальных кассетах, а затем в растильных камерах (рис. 5).

Рис. 5. Растильная камера с вертикальными кассетами

В камере 23 кассеты 55 х 70 мм, просветы между ними выполняют роль воздушных каналов. В камеру размером 1,6 х 1,6 х 1,3 м загружается до 500 кг среды.

5. Измельчение и сушка культуры. Выросшая в неподвижном слое культура представляет собой корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-6 мм. Для этого используют дробилки разных типов (дезинтеграторы, барабанно-зубчатые, ударного действия, шнековые и молотковые).

После дробления культуру, имеющую влажность 40-50 %, высушивают до 10-12 %, чтобы предотвратить инактивацию ферментов. Температура сушки не должна превышать 40 ºС, а длительность не более 30 минут. Наиболее распространенными являются сушилки барабанного типа, снабженные перемешивающими лопатками. Барабан медленно вращается (3-8 об/мин.). Суточная производительность достигает 1,5 тонны.

Готовый порошок упаковывают в крафт мешки по 15-30 кг, снабжая их этикеткой с указанием препарата, его активности и отправляют потребителю.

Несмотря на ряд существенных недостатков, прежде всего связанных с трудоемкостью, ограниченностью использования механизации и автоматизации производственных процессов, недостаточно высоким санитарно-гигиеническим уровнем производства, поверхностный способ культивирования продуцентов ферментов находит широкое применение и имеет определенную перспективу. Главное его достоинство – высокий выход целевых продуктов, богатый комплекс сопутствующих полезных ферментов.