Основные методы биотехнологических исследований

Для получения высококачественных продуктов используются методы селекции. Селекция - направленный отбор мутантов (организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение). К значительному ускорению селекции ведет индуцированный мутагенез - резкое увеличение частоты мутаций объекта при искусственном повреждении генома. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое, рентгеновское или γ-излучение, некоторые химические соединения, вызывающие изменение первичной структуры ДНК. Наиболее часто в качестве мутагента используют азотистую кислоту, акридиновые красители, бромурацил и др. Однако этот метод имеет существенные недостатки - трудоемкость и отсутствие сведений о характере мутаций.

В биотехнологии широко используются методы генетической инженерии, вызывающие модификацию биологических объектов в результате введения искусственных генетических программ. Примером может служить метод соматической гибридизации. Он позволяет скрещивать отдаленные организмы. Для этого, например, растительные, грибные и бактериальные клетки перед слиянием отделяют от клеточной стенки, получая протопласты. Затем деполяризуют наружные цитоплазматические мембраны переменным электрическим или магнитным полем в присутствии катионов . Клеточную стенко ферментативно разрушают (гидролизуют).

В биотехнологическом производстве имеется ряд специфических методов, к ним относятся методы хранения посевного материала, например, лиофильное высушивание - обезвоживание после замораживания при температуре - 44-60°С и ниже. Применяется этот метод в отношении продуцентов антибиотиков.

Криоконсервация- глубокое замораживание клеток с их последующим хранением в жидком азоте (- 196°С) или в парах азота (- 155°С).

При выделении продукта биосинтеза используют метод флотации, например, для отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости (производство пива); фильтрации - это задерживание клеток на пористой фильтрующей поверхности, фильтры при этом изготовляют из самого разнообразного материала и разных конструкций; центрифугирования, то есть осаждения взвешенных в жидкости частиц с использованием центробежной силы.

Разрушение клеточных стенок микроорганизмов для отделения полезного вещества проводят методами физического разрушения, например при помощи ультразвука. Этот метод позволяет целенаправленно выделять какую-либо одну фракцию содержимого клетки, химического и химико-ферментативного разрушения - применяют при получении различных ферментов с использованием толуола или бутанола.

Осаждение растворенных веществ проводят физическим методом (нагревание, охлаждение, разбавление или концентрирование раствора) или химическими методами, которые позволяют переводить нужное вещество в нерастворимое состояние (так пенициллин переводят в кристаллический осадок с помощью соединений калия или натрия; белки осаждают сульфатом аммония, этанолом, ацетоном).

Для извлечения продуктов биосинтеза также используется ряд методов. Экстракция- это извлечение продукта из твердого (твердожидкофазная) или жидкого (жидко-жидкофазная) образца. Адсорбция - частный случай экстракции, когда из жидкости или газа выделяют (экстрагируют) твердое тело. Примером адсорбента служит древесный уголь, пористая глина. Путем адсорбции выделяют антибиотики и витамины.

Концентрирование продукта проводят методами обратного осмоса (против градиента концентрации), ультрафильтрации, то есть с использованием мембранных фильтров (давление колеблется от 20 до 400 кПа, так концентрируют малостабильные продукты - молочную и глютаминовую кислоту, некоторые антибиотики и ферменты), методом выпаривания - наиболее древним методом концентрации (недостаток метода в необходимости нагревания при низком давлении), методом обезвоживания продукта - сушки на подносах на ленточном конвейере с подогревом, в сушильных аппаратах, в вакуум-аппаратах.

Иногда конечный продукт биосинтеза модифицируют с целью придания веществу необходимого для человека свойства, например пенициллин G модифицируют для получения ампициллина, метициллина и др.

Проводят и стабилизацию продукта для сохранения свойств продукта при его хранении, сюда относят и добавление наполнителей, и физико-химическое воздействие, и сушку продукта и др. Стабилизацию кормового микробного белка можно проводить добавляя наполнители из грибного мицелия, пшеничные отрубей, кукурузной муки; стабилизацию ферментов проводят добавлением глицерина, углеводов, неорганических ионов - и др.

В последнее время уделяется большое внимание развитию нанотехнологий, то есть технологий, использующих вещества и материалы в диапазоне размеров до 100 нанометров. Для оценки потенциальных рисков использования таких технологий применяют специфические биотехнологические методы. К ним относят метод щелочного электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») и микроядерный тест. Первый метод основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует от катода к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий «хвост кометы», параметры котрого зависят от степени повреждения исследуемой ДНК. Микроядерный тест используется для выявления цитогенетических аномалий, возникающих под влиянием мутагенов различной природы. При этом число просматриваемых клеток для анализа должно быть не менее 1000, а их расположение однослойным.

Методы биотехнологии и биотехнологических производств весьма многообразны и сложны, а это далеко не полный их перечень.