Питательные среды, принципы их классификации, требования, предъявляемые к питательным средам, условия культивирования микроорганизмов.

Основой бактериологических работ являются питательные среды, нередко определяя своим качеством результаты исследования.

Основные требования, предъявляемые к питательным средам:

1. Питательные среды должны содержать все необходимые для питания микроба питательные вещества, т.е. обладать питательностью.

2. Иметь достаточную влажность

3. Иметь оптимальную рН (7,2-7,6) кислотность среды.

4. Обладать изотоничностью (концентрация NaCl 0,87%), для галофильных бактерий концентрация соли 1% и выше.

5. Иметь оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.

6. Быть прозрачными, чтобы был виден рост бактерий, особенно в жидких средах.

7. Быть стерильными (чтобы не было других бактерий).

Для приготовления питательных сред используют продукты животного происхождения (мясо, рыба, кровь, яйца, молоко) и продукты растительного происхождения (картофель). Также используют синтетические питательные среды, составленные из химических соединений.

Источником азота для бактерий служат простые аммонийные соединения, аминокислоты или пептоны; источником углерода – сахар, многоатомные спирты, органические кислоты. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCl, КН₂РО₄, К₂НРО₄.

В зависимости от консистенции питательные среды могут быть: жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара. Агар- полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 оС, остывает при температуре 45-50 оС. Для полужидких сред агар добавляют в концентрации 0,5%, для плотных – 1,5-2%. Жидкие среды не содержат агар-агара.

По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, мясопептонный бульон, мясопептонный агар, агар Хоттингера. Сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (сахарный, сывороточный, желчный бульоны, кровяной, сывороточный, желточно-солевой агары, среда Кита-Тароцци, Вильсона-Блера).

В зависимости от назначения среды подразделяются:

1. Общего назначения –для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, кровяной агар).

2. Специального назначения:

а) элективные среды – это среды, на которых растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9, служит для выделения холерного вибриона.

б) среды обогащения – это такие среды, которые стимулируют рост какого-то определенного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, магниевая и селенитовая среды стимулируют рост бактерий рода сальмонелла, ингибируя рост кишечной палочки.

в) дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий (среды Гисса).

г) комбинированные питательные среды сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры и дифференциально-диагностическую (среда Плоскирева для выделения шигелл, висмут-сульфитный агар – для сальмонелл). Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки.

С целью дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий используют селективные среды. Прототрофы растут на минимальной среде, содержащей только соли и углеводы, так как они сами способны синтезировать нужные им для развития метаболиты. Ауксотрофы нуждаются в средах, содержащих определенные аминокислоты, витамины, т.е. факторы роста.

Приготовление питательных сред – один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической работы.

В настоящее время медицинской промышленностью организовано производство консервированных сред. Сухие питательные среды находятся в пластмассовых банках с плотно завинчивающимися крышками, обеспечивающими герметичность.

Условия культивирования бактерий:

1. Наличие полноценной питательной среды.

2. Определенная температура культивирования (оптимальная температура 37⁰С).

3. Определенная атмосфера культивирования. Для строгих аэробов необходим кислород, поэтому они хорошо растут на поверхности агара чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для роста аэробов в глубинном слое жидкой среды необходимо непрерывно перемешивать или встряхивать питательные среды, чтобы кислород распределялся по всему объему среды. Для факультативных анаэробов используют те же методы. Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода. Концентрация СО₂ должна быть 1-5%. Для этого используют специальные СО₂ –инкубаторы или посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горячую свечу. Для роста облигатных анаэробов необходимо исключить доступ кислорода. Для этого добавляют к питательным средам редуцирующих кислород веществ (тиогликолевая кислота), регенерация от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения, использование поглотителей кислорода, помещая их в герметически закрываемые емкости «газпаки», использование анаэростатов.

4. Время культивирования (18-48 часов). Для культивирования микобактерий туберкулеза (3-4 недели).

5. Освещение. Для выращивания фототрофных бактерий необходим свет.

6. Культивирование облигатных внутриклеточных паразитов-бактерий, относящихся к родам риккетсия, эрлихия, коксиелла, хламидия осуществляют на культурах клеток или в организме животных и членистоногих, а также в куриных эмбрионах.

В промышленных условиях для получения биомассы бактерий или грибов с целью получения антибиотиков, вакцин, диагностических препаратов культивирование осуществляется в аппаратах (ферментерах) при строгом соблюдении оптимальных параметров роста и размножения культур.

Питание бактерий.

Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки.

Среди необходимых питательных веществ выделяют: углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций. Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.

Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ.

В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на: 1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО₂); 2) гетеротрофы (используют органический С-гексозы, многоатомные спирты, аминолкислоты);

Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки. По источникам энергии микроорганизмы делят на: 1) фототрофы – источник солнечная энергия; 2) хемотрофы – получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций; 3) хемолитотрофы – используют неорганические соединения; 4) хемоорганотрофы – используют органические вещества.

Медицинская микробиология изучает бактерии, которые являются гетерохемоорганотрофы.

По степени гетеротрофности микроорганизмы делятся на: 1) сапрофиты – питаются мертвым органическим материалом; 2) паразиты – питаются за счет макроорганизма. Облигатные паразиты полностью лишены возможности жить вне клеток (риккетсии, хламидии, вирусы). Факультативные паразиты могут жить и без хозяина, т.е. вне организма – на простых питательных средах.

Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост. Среди бактерий выделяют: 1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества); 2) ауксотрофы (нуждаются в факторах роста).

Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений.

Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку: I. Пассивный транспорт (без энергетических затрат): простая диффузия; 2) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков). II. Активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны).

Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией.