Вопрос 38. Нуклеиновые кислоты и белки

1. Функции вирусных нуклеиновых кислот

2. Вирусные белки

3. Процессы взаимодействия вируса с клеткой макроорганизма

1.Функция вирусных нуклеиновых кислот независимо от их типа состоит в хранении и передаче генетической информации. Ви­русные ДНК могут быть линейными (как у эукариотов) или кольцевыми (как у прокариотов), однако в отличие от ДНК тех и других она может быть представлена однонитевой молеку­лой. Вирусные РНК имеют разную организацию (линейные, кольцевые, фрагментированные, однонитевые и двунитевые), они могут быть представлены плюс- или минус-нитями. Плюс-нити функционально тождественны и-РНК, т. е. спо­собны транслировать закодированную в них генетическую ин­формацию на рибосомы клетки хозяина.

Минус-нити не могут функционировать как и-РНК, и для трансляции содержащейся в них генетической информации необходим синтез комплементарной плюс-нити. РНК плюс-нитевых вирусов, в отличие от РНК минус-нитевых, имеют специфические образования, необходимые для узнавания рибосомами. У двунитевых как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов информация обычно записана только в одной цепи, чем достигается экономия генетического материала. 2. Вирусные белки по локализации в вирионеделятся:

• на капсидные;

• белки суперкапсидной оболочки;

• геномные.

Белки капсидной оболочки у нуклеокапсидных вирусов вы­полняют защитную функцию — защищают вирусную нуклеино­вую кислоту от неблагоприятных воздействий — и рецептор-ную (якорную) функцию, обеспечивая адсорбцию вирусов на клетках хозяина и проникновение в них.

Белки суперкапсидной оболочки, как и белки капсидной обо­лочки, выполняют защитную и рецепторную функции. Это сложные белки — липо- и гликопротеиды. Некоторые из этих белков могут формировать морфологические субъединицы в виде шипованных отростков и обладают свойствами гемагглю-тининов (вызывают агглютинацию эритроцитов) или нейрами-нидазы (разрушают нейраминовую кислоту, входящую в состав клеточных стенок).

Отдельную группу составляют геномные белки, они ковалентно связаны с геномом и образуют с вирусной нуклеиновой кисло­той рибо- или дезоксирибонуклеопротеиды. Основная функ­ция геномных белков — участие в репликации нуклеиновой кислоты и реализации содержащейся в ней генетической ин­формации, к ним относятся РНК-зависимая РНК-полимераза и обратная транскриптаза.

В отличие от белков капсидной и суперкапсидной оболочки это не структурные, а функциональные белки. Все вирусные белки выполняют и функцию антигенов, по­скольку являются продуктами вирусного генома и, соответст­венно, чужеродными для организма хозяина. Представители царства Vira по типу нуклеиновой кислоты де­лятся на 2 подцарства — рибовирусные и дезоксирибовирусные. В подцарствах выделяют семейства, рода и виды. Принад­лежность вирусов к тому или иному семейству (всего их 19) оп­ределяется:

•строением и структурой нуклеиновой кислоты;

• типом симметрии нуклеокапсида;

• наличием суперкапсидной оболочки. Принадлежность к тому или иному родуи виду связана с другими биологическими свойствами вирусов:

• размером вирионов (от 18 до 300 нм);

• способностью размножаться в культурах ткани и курином эм­брионе;

• характером изменений, происходящих в клетках под воздейст­вием вирусов;

• антигенными свойствами;

• путями передачи;

• кругом восприимчивых хозяев.

Вирусы — возбудители болезней человека относятся к 6 ДНК-содержащим семействам (поксвирусы, герпесвирусы, гепаднави-русы, аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы) и 13 семействам РНК-содержащих вирусов (реовирусы, тогавирусы, флавирусы, коронавирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы, рабдовирусы, бунъявирусы, аренавирусы, ретровирусы, пикорнавиру-сы, калицивирусы, филовирусы).

3. Взаимодействие вируса с клеткой — это сложный процесс, ре­зультаты которого могут быть различны. По этому признаку (конечный результат) можно выделить 4 типа взаимодействия вирусов и клеток:

%/ продуктивная вирусная инфекция — это такой тип взаимодейст­вия вируса с клеткой, при котором происходит репродукция ви­русов, а клетка погибает (для бактериофагов такой тип взаи­модействия с клеткой называют литическим). Продуктивная вирусная инфекция лежит в основе острых вирусных заболева­ний, а также в основе условных латентных инфекций, при ко­торых погибают не все клетки пораженного органа, а только часть, а остальные неповрежденные клетки этого органа ком­пенсируют его функции, вследствие чего заболевание некото­рое время не проявляется, пока не наступит декомпенсация;

• абортивная вирусная инфекция — это такой тип взаимодействия вируса с клеткой, при котором репродукция вирусов не происхо­дит, а клетка избавляется от вируса, функции ее при этом не нарушаются, поскольку это происходит только в процессе ре­продукции вируса;

• латентная вирусная инфекция — это такой тип взаимодействия вируса склеткой, при котором происходит репродукция и виру­сов, и клеточных компонентов, но клетка не погибает; при этом клеточные синтезы преобладают, и поэтому клетка достаточно длительно сохраняет свои функции — этот механизм лежит в основе безусловных латентных вирусных инфекций;

• вирус-индуцированные трансформации — это такой тип взаимо­действия вируса с клеткой, при котором клетки, пораженные вирусом, приобретают новые, ранее не присущие им свойства. Геном вируса или его часть встраивается в геном клетки, и ви­русные гены превращаются в группу клеточных генов. Этот интегрированный в хромосому клетки-хозяина вирусный ге­ном называется провирусом, а такое состояние клеток обозна­чается как вирогения.

При любом из указанных типов взаимодействия вирусов и клеток можно выделить процессы, направленные на то, чтобы доставить вирусную нуклеиновую кислоту в клетку, обеспечить условия имеханизмы ее репликации и реализации содержа­щейся в ней генетической информации.

Вопрос 39.Особенности репродукции вирусов

1. Периоды осуществления продуктивной вирусной инфекции

2. Репликация вируса

3. Трансляция

1.Продуктивная вирусная инфекция осуществляется в 3 периода:

• начальный период включает стадии адсорбции вируса на клетке, проникновения в клетку, дезинтеграции (депротеинизации) или "раздевания" вируса. Вирусная нуклеиновая кислота была доставлена в соответствующие клеточные структуры и под дей­ствием лизосомальных ферментов клетки освобождается от защитных белковых оболочек. В итоге формируется уникаль­ная биологическая структура: инфицированная клетка содер­жит 2 генома (собственный и вирусный) и 1 синтетический аппарат (клеточный);

• после этого начинается вторая группа процессов репродукции вируса, включающая средний и заключительный периоды, во время которых происходят репрессия клеточного и экспрессия вирусного генома. Репрессию клеточного генома обеспечивают низкомолекулярные регуляторные белки типа гистонов, синтезируемые в любой клетке. При вирусной инфекции этот про­цесс усиливается, теперь клетка представляет собой структуру, в которой генетический аппарат представлен вирусным геномом, а синтетический аппарат — синтетическими системами клетки.

2. Дальнейшее течение событий в клетке направлено на репликацию вирусной нуклеиновой кислоты(синтез генетического материала для новых вирионов) и реализацию содержащейся в ней генети­ческой информации (синтез белковых компонентов для новых вирионов). У ДНК-содержащих вирусов, как в прокариотиче-ских, так и в эукариотических клетках, репликация вирусной ДНК происходит при участии клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. При этом у однонитевых ДНК-содержащих вирусов сначала образуется комплементарная нить — так назы­ваемая репликативная форма, которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК.

3. Реализация генетической информации вируса, содержащейся в ДНК, происходит следующим образом: при участии ДНК-зави­симой РНК-полимеразы синтезируются и-РНК, которые по­ступают на рибосомы клетки, где и синтезируются вирусспе-цифические белки. У двунитевых ДНК-содержащих вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина, это собственный геномный белок. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки, используют содержащуюся там клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу.

У РНК-содержащих вирусов процессы репликации их генома, транскрипции и трансляции генетической информации осуще­ствляются иными путями. Репликация вирусных РНК, как минус-, так и плюс-нитей, осуществляется через репликативную форму РНК (комплементарную исходной), синтез которой обеспечивает РНК-зависимая РНК-полимераза — это геном­ный белок, который есть у всех РНК-содержащих вирусов. Ре­пликативная форма РНК минус-нитевых вирусов (плюс-нить) служит не только матрицей для синтеза дочерних молекул ви­русной РНК (минус-нитей), но и выполняет функции и-РНК, т. е. идет на рибосомы и обеспечивает синтез вирусных белков (трансляцию).

У плюс-нитевых РНК-содержащих вирусов функцию трансля­ции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется че­рез репликативную форму (минус-нить) при участии вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз.

У некоторых РНК-содержащих вирусов (реовирусы) имеется со­вершенно уникальный механизм транскрипции. Он обеспечива­ется специфическим вирусным ферментом — ревертазой (обрат­ной транскриптазой) и называется обратной транскрипцией. Суть ее состоит в том, что вначале на матрице вирусной РНК при участии обратной транскрипции образуется транскрипт, представляющий собой одну нить ДНК. На нем с помощью клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется ,вторая нить и формируется двунитевой ДНК-транскрипт. С не­го обычным путем через образование и-РНК происходит реа­лизация информации вирусного генома.

Результатом описанных процессов репликации, транскрипции и трансляции является образование дочерних молекул вирусной нуклеиновой кислоты и вирусных белков, закодированных в геноме вируса.

После этого наступает третий, заключительный период взаимо­действия вируса и клетки. Из структурных компонентов (нук­леиновых кислот и белков) на мембранах цитоплазматического ретикулума клетки собираются новые вирионы. Клетка, геном которой был репрессирован (подавлен), обычно гибнет. Вновь сформировавшиеся вирионы пассивно (в результате гибели клетки) или активно (путем почкования) покидают клетку и оказываются в окружающей ее среде.

Таким образом, синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков и сборка новых вирионов происходят в определенной последова­тельности (разобщены во времени) и в разных структурах клетки (разобщен в пространстве), в связи с чем способ репро­дукции вирусов и был назван дизъюнктивным (разобщенным). При абортивной вирусной инфекции процесс взаимодействия вируса с клеткой по тем или иным причинам прерывается до того, как произошло подавление клеточного генома. Очевидно, что в этом случае генетическая информация вируса реализова­на не будет и репродукции вируса не происходит, а клетка со­храняет свои функции неизменными.

При латентной вирусной инфекции в клетке одновременно функционируют оба генома, а при вирус-индуцированных трансформациях вирусный геном становится частью клеточно­го, функционирует и наследуется вместе с ним.

Вопрос 40.Культивирование вирусов в культурах тканей

1. Характеристики тканевых культур

2. Цитопатическое действие вирусов

1.Для культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, раз­вивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще — эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращива­ния клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения рН среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения.

Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жиз­неспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедея­тельность, но и активно делятся.

В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) — чаще в один слой (однослойные), а всуспензированных —взвешены в жидкой среде. По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:

• первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей;

• полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;

• перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в те­чение неопределенно длительного срока вмногочисленных ге­нерациях.

Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры.

2. О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по ци-топатическому действию (ЦПД):

• деструкции клеток;

• изменению их морфологии;

• формированию многоядерных симпластов или синтиция в ре­зультате слияния клеток.

• в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут об­разовываться включения — структуры, не свойственные нор­мальным клеткам.

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

По локализации в клетке различают:

• цитоплазматические;

• ядерные;

• смешанные включения.

Характерные ядерные включения формируются в клетках, за­раженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тель­ца Бабеша-Негри) и др.

О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу "бляшек" (негативных колоний). При культивирова­нии вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте пораженных клеток образуются зоны деструкции моно-сом — так называемые стерильные пятна, или бляшки. Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл сре­ды (считается, что одна бляшка является потомством одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по фе­номену бляшкообразования.

Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, мож­но считать реакцию гемадсорбции. При культивировании виру­сов, обладающих гемагглютжирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти моле­кулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбиро­вать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней нака­пливаются новые вирионы) приобретет способность вызывать гемагглютинацию.

Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод "цветной пробы". При размножении в питательной среде с индикатором незараженных

клеток культуры ткани вследствие образования кислых продук­тов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.

Вопрос 41.Механизмы противовирусной защиты макроорган изма