Выявление аллелей бетта-глобинового гена методом гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами
С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены человека, отличающиеся друг от друга лишь одной парой оснований, проводя гибридизацию с протяженным (более 100 п. н.) зондом. В 1983 г. Коннер и др. синтезировали специфичные олигонуклеотиды, способные распознавать нормальную и мутантную ДНК, при этом можно было установить, гомозиготен или гетерозиготен данный индивидуум по исследуемому гену. Для диагностики серповидноклеточной анемии они использовали два олигонуклеотида длиной по 19 п. н.: один был комплементарен нормальному аллелю b-глобинового гена (bА), а другой — мутантному (bs). ДНК здорового человека (bАbА) гибридизовалась только с bА-зондом, ДНК больного серповидноклеточной анемией (bSbS) — только с b5-зондом, а ДНК индивидуума, гетерозиготного по данному гену (bAbs), — с обоими зондами. Эта модельная система впервые продемонстрировала возможность определения генотипов с помощью гибридизации и положила начато молекулярной диагностике многих генетических заболеваний человека. Вслед за этим был разработан целый ряд ДНК-тестов для выявления мутаций. И хотя гибридизационный метод сейчас уступил место более совершенным методам, таким как ПЦР и ЛОЗ (лигирование олигонуклеотидных зондов), он сыграл свою роль, проиллюстрировав возможность определения точковых мутаций.
Выявление Trypanosoma cruzi
Паразитическое простейшее Trypanosoma cruzi вызывает болезнь Чагаса (южноамериканский трипаносомоз), уносящую ежегодно примерно 50 тыс. жизней. Паразит широко распространен в Латинской Америке. Он переносится клопами-хищнецами, проникает в печень, селезенку, лимфатические узлы, центральную нервную систему и, размножаясь, разрушает клетки, в которых паразитирует. Для диагностики острой формы болезни Чагаса обычно проводят микроскопическое исследование свежей пробы периферической крови. Можно использовать и другой тест, более длительный, но выявляющий паразитов с большей вероятностью. Незараженных насекомых кормят кровью пациента и через 30-40 сут исследуют под микроскопом их кишечник на предмет наличия паразитов. Оба метода весьма трудоемки, дорогостоящи и требуют длительного времени. Болезнь можно диагностировать и иммунологическими методами, однако они часто дают ложноположительные результаты. В качестве альтернативы этим менее чем удовлетворительным процедурам было разработано несколько подходов, основанных на применении ПЦР. В настояшее время ГЦР-диагностика болезни Чагаса служит дополнением к традиционным, широко используемым методам.
Один из ПЦР-тестов основан на выявлении фрагмента ДНК длиной 188 п. н., который присутствует во множестве копий в геноме Т. cruzi, но отсутствует в геномной ДНК нескольких родственных паразитов. После амплификации этот фрагмент без труда обнаруживается с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Незначительно варьируя методику проведения ПЦР (например, изменяя нуклеотидную последовательность праймеров), последнюю можно использовать для обнаружения широкого спектра бактерий, вирусов и паразитов.
Нерадиоактивные методы детекции
В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии.
Однако 32Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечивать безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы нерадиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй испускает свет. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. Гибридизация и детекция сигнала проводятся более или менее стандартным образом.
1. Зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишенью.
2. Промывают фильтр для удаления избытка несвязавшегося зонда.
3.Добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина).
4. Добавляют биотинилированный фермент - щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена .
5. В зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминесцентный субстрат и регистрируют изменение окраски либо люминесценцию, сопровождающую превращение субстрата в продукт.
В качестве альтернативы после гибридизации ДНК с биотинилированным зондом можно добавлять уже готовый комплекс стрептавидин—фермент, имеющий сайт связывания с биотином.
Как авидин, так и стрептавидин связываются с биотином очень прочно (константа диссоциации (Kd = 10-15); кроме того, каждый из белков имеет четыре независимых биогинсвязывающих сайта, благодаря чему одна молекула авидина или стрептавидина может одновременно присоединять фермент и зонд, меченные биотином. Биотинилирование и связывание со стрептавидином не приводят к снижению ферментативной активности. В хромогенных системах детекции в том месте, где находится гибридная ДНК, под действием фермента образуется нерастворимый краситель, а в хемилюминесцентных системах — продукт, который испускает свет.
Нерадиоактивные системы детекции обладают и другими преимуществами: биотинилированная ДНК остается стабильной при комнатной температуре как минимум год; методы регистрации хемилюминесценции обладают такой же чувствительностью, как и методы регистрации радиоактивного сигнала; детекция испускаемого света при помощи рентгеновской пленки или люминометра, как и регистрация изменения цвета, занимают несколько часов По-видимому, хемилюминесцентные системы регистрации сигнала, все же более чувствительные, чем хромогенные, вскоре вытеснят вес остальные, использующиеся при ДНК-диагностике. Если при этом применяется ПЦР, то амплифицируемый продукт можно пометить флуоресцентным красителем, присоединяя его к 5'-концу каждого праймера. В качестве красителей часто используют флуоресцеин и родамин, которые испускают зеленый и красный свет соответственно. После ПЦР-амплификации ДНК-мишени проводят разделение флуоресцеин-меченного праймера и продуктов амплификации, после чего регистрируют включение метки. Если ДНК-мишень в образце отсутствует, то не будет образовываться и флуоресцирующий продукт.
Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда — «молекулярного маяка». Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. Средние 15 из них комплементарны ДНК-мишени и не спариваются друг с другом, а 5 концевых нуклеотидов взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5'-концу присоединен флуоресцентный хромофор (флуорофор), а к З'-концу — нефлуоресцентный хромофор (тушитель), на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре «маяк» имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находятся в тесном контакте, и флуоресценция флуорофора тушится. Когда же 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуются с комплементарной последовательностью ДНК- или РНК-мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя, и зонд испускает свет. Температура, реакционной смеси должна быть близка к комнатной, поскольку при ее повышении шпилька денатурирует, флуорофор и тушитель расходятся и происходит флуоресценция. Необходимо также, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарны соответствующей последовательности ДНК- или РНК-мишени.
Геномная дактилоскопия
Метод геномной дактилоскопии (ДНК-типирование) часто используется в судебной медицине для идентификации биологических образцов. С его помощью можно доказать, что подозреваемый действительно совершил преступление, или, напротив, что он невиновен. Для проведения ДНК-типирования сначала берут часть биологического образца (пробу крови, сперму, кусочек кожи, волосы) и определяют, достаточно ли в нем интактной ДНК для последующего анализа. Затем ДНК подвергают эндонуклеазному расщеплению, полученные фрагменты разделяют в агарозном геле и переносят на найлоновый фильтр. Проводят последовательную гибридизацию с четырьмя или пятью радиоактивно меченными зондами, каждый из которых распознает определенную последовательность ДНК (при этом перед гибридизацией со следующим зондом предыдущий полностью удаляют с мембраны). После каждой гибридизации с помощью радиоавтографии визуализируют полосы, отвечающие продуктам гибридизации зонда с рестрицированной ДНК, и строят «лестницу фрагментов» для всех образцов. Каждый этап (гибридизация и радиоавтография) длится от 10 до 14 сут, так что вся процедура может занять много недель и даже несколько месяцев. В качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК, многократно встречающиеся в геноме человека и состоящие из тандемно повторяющихся участков. Длина повторов варьирует от 9 до 40 п. н., а их число — от 10 до 30; при этом одни и те же минисателлитные последовательности у разных индивидов могут иметь разную длину. Эти различия возникают в результате увеличения или уменьшения числа тандемных повторов, по-видимому, в ходе репликации ДНК. Никаких биологических последствий такие вариации не имеют, поскольку минисателлитные ДНК не кодируют белков. Ребенок наследует одну минисателлитную последовательность от одного родителя, а другую - от другого. «ДНК-отпечаток» данного индивида представляет собой набор различающихся по длине фрагментов, соответствующих минисателлитным последовательностям его генома. Ввиду большого разнообразия этих повторов вероятность того, что в популяции найдется два человека с идентичными «ДНК-отпечатками», равна 10-5-10-8. Другими словами, характер расположения полос минисателлитных ДНК почти столь же индивидуален, как и отпечатки пальцев. Геномную дактилоскопию применяют также при установлении отцовства. Часть полос «ДНК-отпечатка»ребенка должна соответствовать полосам материнского «отпечатка», а часть «отцовского». Если ДНК в исследуемом образце недостаточно, но она не очень сильно разрушена, можно амплифицировать небольшие участки минисателлитной ДНК с помощью ПЦР, а затем провести их секвенирование, этот метод более чувствителен.
Использование полиморфных ДНК-маркеров
Метод «ДНК-отпечатков» может оказаться полезным и при установлении различий между растительными культурами. Один из вариантов этого метода основан на использовании полиморфных ДНК-маркеров для амплификации случайных фрагментов (random amplified polymorphic DNA, RAPD). Для этого берут произвольные праймеры длиной 9—10 нуклеотидов, не содержащие палиндромных последовательностей и имеющие GС-содержание 50—80%, и добавляют их по отдельности к препаратам хромосомной ДНК растений. Каждая ПЦР инициируется одним праймером, который должен быть способен связываться с обеими цепями ДНК-мишени. Нуклеотидные последовательности всех олигонуклеотидов известны, но какой из них окажется эффективным инициатором ПЦР, неясно. Если праймер гибридизуется с обеими цепями ДНК-мишени в подходящей ориентации и сайты расположены на расстоянии от 100 до 3000 п. н. друг от друга, то фланкированный ими сегмент ДНК будет амплифицирован, а полученный фрагмент можно выделить с помощью гель-электрофореза и визуализировать окрашиванием. Число разных фрагментов ДНК, образующихся при амплификации, зависит от праймера и геномной ДНК. Для одних и тех же праймера и ДНК-мишени продукты амплификации будут каждый раз одинаковыми, а замена лишь одного нуклеотида в праймере приведет к полной смене набора получаемых фрагментов. Таким образом, используя один и тот же набор олигонуклеотидных праймеров, можно сравнивать RAPD-«ДНК-отпечатки» разных растительных культур, а следовательно, и сами культуры. Для выявления различий между двумя очень близкими сортами или культурами растений часто приходится использовать несколько произвольных праймеров с известной нуклеотидной последовательностью. Как и все другие молекулярные маркеры, RAPD можно применять для характеристики целых геномов, отдельных хромосом или генов.
По сравнению с другими методами идентификации сложных ДНК метод RAPD обладает следующими преимуществами: 1) для всех видов растений можно использовать один и тот же (универсальный) набор олигонуклеотидных праймеров; 2) не нужно создавать геномные библиотеки, использовать радиоактивные зонды, проводить гибридизацию, т. е. можно легко и быстро охарактеризовать большое количество образцов; 3) процесс можно автоматизировать. Кроме того, для проведения обычной ПЦР необходимо знать нуклеотидную последовательность искомого гена или его фрагмента — мишени для амплификации. В случае же RAPD амплифицируется любой участок генома, содержащий две комплементарные праймеру последовательности, которые фланкируют сегмент ДНК длиной от 100 до 3000 п. н.
С помощью метода RAPD удалось отличить друг от друга шесть инбредных линий кукурузы и показать, что ПЦР-продукты гибридов кукурузы представляют собой сочетание ПЦР-продуктов родительских инбредных линий. RAPD-маркеры использовали также для скрининга разных штаммов грибов Leptosphaeria maculans, вызывающих заболевание «черная ножка» у крестоцветных. Было установлено различие между невирулентным (не приводящим к развитию болезни) и вирулентным (вызывающим заболевание) штаммами.
Дата добавления: 2016-05-11; просмотров: 1031;