ВЛИЯНИЕ ПЕРЕСТРОЕК КАРИОТИПА НА ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ.

Еще одна категория мутационных изменений – хромосомные аберрации – также могут влиять на функции ЦНС. Из млекопитающих наиболее изученными в этом отношении оказались мыши.

Как известно, существует целый ряд хромосомных аномалий, возникновение которых в той или иной степени нарушает баланс физиологических процессов в организме. Наиболее известный и яркий пример трагического следствия подобного дисбаланса – так называемый синдром Дауна (см.: 8.6.5.6). В кариотипе мыши описаны практически все известные типы аномалий хромосом, достаточно подробно проанализировано их влияние на эмбриогенез (см.: Дыбан, Баранов, 1977), однако исследование поведения таких мутантов проводилось лишь в отдельных случаях.

В кариотипе мыши описано большое число хромосомных транслокаций*. Линии мышей, носителей мутаций этой категории, поддерживаются в лабораториях и питомниках, как например в Джексо-новской лаборатории, наряду с другими инбредными мутантными линиями (см.: 8.1.1).

Влияние хромосомных аномалий на функцию ЦНС и поведение мышей одним из первых предложил исследовать отечественный эмбриолог проф. А.П. Дыбан (1976). На основании данных по специфическому влиянию такого рода аномалий на ход эмбриогенеза мыши он предположил, что характер влияния хромосомных перестроек на поведение может зависеть от типа хромосомной перестройки. Первой работой в этой области был анализ способности к обучению реакции активного избегания у мышей-трисомиков по маркерной хромосоме 715, возникшей в результате транслокации – изменения строения хромосом 13 и 14 (Федоров и др., 1973). Мыши-трисомики, исследованные этими авторами, достоверно отставали в скорости приобретения навыка.

Далее, в совместной работе А.П. Дыбана и B.C. Баранова с Л.В. Кру-шинским и его сотрудниками было проанализировано поведение мышей-носителей так называемых робертсоновских транслокаций". Мыши-носители таких хромосомных перестроек заметно не отличаются ни по физическому развитию, ни по плодовитости. В лабораторных условиях их разводят так же, как животных обычных лабораторных линий.

Для анализа возможных особенностей поведения мышей с роберт-соновскими транслокациями был использован тест на способность

Транслокация – разрыв одной или двух хромосом, вследствие чего участок одной хромосомы переносится на другую и/или образуется отдельная дополнительная хромосома

"Робертсоновская транслокация – это слияние двух акроцентрических (т е палочковидных) хромосом с образованием одной мета- или субметацентрической Цитогенетические исследования показывают, что количество генетического материала при этих транслокациях заметно не изменяется (хотя область околоцентромерного гетерохроматина, по некоторым данным, оказывается измененной) к экстраполяции направления движения раздражителя, предложенный ранее Л.В. Крушинским (1986) для сравнения элементарной рассудочной деятельности животных разных видов, в частности крыс разного генотипа.

Суть методики заключалась в следующем: через небольшое отверстие в стенке камеры предварительно лишенное пищи животное начинало пить молоко. Кормушка с молоком, расположенная за этим отверстием, могла свободно перемещаться вправо или влево от мыши, причем ей был виден только начальный участок этой траектории. Иными словами, мышь получала информацию об исчезновении пищи и о направлении, в котором она исчезла. Задача заключалась в том, чтобы подойти к той стороне стенки, в направлении которой переместилась кормушка. Если доля правильных решений задачи (от всего числа предъявлений теста) достоверно отличалась от 50%-го (случайного) уровня, можно было делать вывод о неслучайном выборе "правильного" направления поиска. Следует сразу отметить, что подавляющее большинство тестированных мышей инбредных линий и аутбредных стоков давали в среднем именно 50%-й (т.е. случайный) уровень решения этого теста.

Способность к экстраполяции была проанализирована у значительного числа мышей, имевших в кариотипе робертсоновские транслокации разных хромосом. У животных Rb(6,15)1 Aid, Rb(9,14)6Bnr, Rb(16.17)7Bnr, Rb(5,19) 1 Wh (в скобках указаны номера хромосом, вовлеченных в слияние) доля правильных решений этого теста также не отличалась от 50%-го случайного уровня. В то же время при слиянии хромосом 8 и 17 (это были транслокации Rb(8,17)llem и Rb(8,17)6Sic, возникшие совершенно независимо и найденные в разных лабораториях) мыши были способны к экстраполяции (Крушинский и др., 1986). Они отличались и по способности к пространственной ориентации в лабиринте Морриса (см.: 8.6.7.2), но в данном тесте их показатели были достоверно хуже, чем у мышей с нормальным кариотипом (Leitingei ct al., 1994). Специальные эксперименты показали, что такие отклонения поведения связаны с наличием в кариотипе именно данной робертсоновской транслокации, поскольку они встречались у мышей с разным генетическим фоном (Крушинский и др., 1986). Эта хромосомная мутация – слияние хромосом 8 и 17 – вызывает также изменения в содержании мозговых моноаминов, что, несомненно, свидетельствуют о ее влиянии на фунцкию ЦНС. По-видимому, феномен отражает так называемый эффект положения – изменение функции генетических элементов в зависимости от местоположения их в геноме. Нельзя исключить, что слияние хромосом изменяет их пространственное расположение в интерфазном ядре, а это, в свою очередь, может повлиять на процессы экспрессии некоторых генов.

8.6.4.3. ВЛИЯНИЕ НА ПОВЕДЕНИЕ МУТАЦИЙ ГЕНОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ НЕВРОЛОГИЧЕСКИЕ отклонения. Выше (см.: 8.5.4), при рассмотрении способов выявления первичного эффекта действия гена, мы касались проблемы нейрогенеза при неврологических мутациях. Вместе с тем, неврологические мутации интересны для генетики поведения и по ряду других причин. Генетические особенности поведения ин-бредных и селектированных линий мышей и крыс, а также мутант-ных линий и стоков с мутациями, затрагивающими отдельные звенья метаболизма, как правило, выражаются в виде слабых, хотя и достоверных отклонений. В то же время моногенные неврологические мутации, выявление которых стало возможным в условиях массового разведения мышей в питомниках, вызывают заметные отклонения в поведении. Эти мутации сопровождаются снижением жизнеспособности животных, у них сильно выражены отклонения в двигательной сфере, а морфология мозга или отдельных его структур в значительной степени изменена.

Все неврологические мутации – это моногенные нарушения. Наблюдения за мутантными животными позволяют составить "реестр" нарушений в двигательной и сенсорной сферах, а также нарушений поведения.

Поскольку одновременно проводится исследование первичных причин этих неврологических мутаций (см.: 8.5.4), сопоставление всего набора плейотропных эффектов первичного генетического дефекта с нарушением синтеза структурных или регуляторных белков на определенных стадиях развития поможет создать более полное представление о формировании, по крайней мере, самых простых функций мозга. В этом отношении неврологические мутации представляют собой потенциально мощный источник будущих знаний о мозге млекопитающих.

Внешне неврологические мутации проявляются в первую очередь в виде аномальной походки, трудностей в поддержании позы, нарушении способности к плаванию, исследовательскому поведению, в развитии судорожных состояний разной степени тяжести (Полетаева, Романова, 1990).

Первоначально эти дефекты связывали с нарушениями строения мозжечка и/или внутреннего уха, а также (у другой группы мутаций) с демиелинизацией мозга. Более подробные исследования позволили установить, что у таких мутантов нарушено строение продолговатого, среднего и переднего мозга, в том числе и гиппокампа.

Ниже приведен краткий и по этой причине неполный перечень аномалий поведения при неврологических мутациях мыши. Поскольку почти все неврологические мутации рецессивны, а гомозиготные по ним особи мало жизнеспособны (у них укорочена продолжительность жизни и резко снижена способность к размножению) мутантные линии поддерживают путем скрещивания между собой гетерозиготных мышей. При этом в потомстве обнаруживаются как гомо- и гетерозиготы, так и нормальные особи, которые обычно служат контролем при проведении исследований поведения мутантов.

Судорожные состояния.Судороги сопровождают мутации демие-линизации (например, quacking), а также -weaver, Lurcher и tottering. Судороги в ответ на действие сильного звука (так называемая аудио-генная эпилепсия) обнаружены у мышей линии 10J/HY, у которых мутация локализована в локусе, отвечающем за репарацию ДНК.

При мутации tottering (tg – ген локализован в 8-й хромосоме) наблюдается целый ряд аномальных фенотипических признаков. К их числу относятся повышенное содержание в мозге норадреналина и увеличение числа норадренергических терминалей нейронов голубого пятна (locus coeruleus – ядро продолговатого мозга). В другой мощной норадренергической системе мозга – в латеральных отделах покрышки (tegmentum) изменений не обнаружено. У гомозиготных особей tg/tg увеличено число адренергических аксонных терминалей нейронов голубого пятна на клетках новой коры, латерального коленчатого тела, гиппокампа, коры мозжечка, кохлеарного ядра. Ни размеры мозга, ни структура клеток, ни число норадренергических нейронов голубого пятна не отклоняются от нормы. В то же время у мутантов tg/tg периодически возникают эпилептиформные разряды в ЭЭГ, так называемые комплексы "пик-волна", а также судорожные припадки.

Более подробный анализ показал, что этот судорожный синдром, по-видимому, относится к категории типичных вторичных эффектов. Полагают, что повышенный уровень норадреналина в мозге этих мутантов вызывает компенсаторные изменения – снижение числа адренорецепторов на нейронах, что может повлечь за собой снижение чувствительности к норадреналину и далее – развитие судорог (см. также: 8.6.5.1).

Гнездостроительное и материнское поведение.Мышь-самка с мутацией staggerer (sg, 9-я хромосома, гибель почти 75% клеток Пурки-нье и почти всех клеток-зерен) не поедает плаценту и не слизывает амниотические оболочки новорожденных мышат, не собирает детенышей в гнездо, а, наоборот, разбрасывает их. Она даже не перекусывает пуповину. Тем не менее^А если собственный помет такой самки на несколько дней забрать от матери и подложить для выкармливания нормальной приемной матери, а самой мутантной самке подложить более старших по возрасту 4-дневных детенышей, то впоследствии у нее может проявиться материнское поведение. Для этого самку с детенышами следует поместить в очень тесную клетку, в которой она не может "раскидать" детенышей и поэтому оказывается в состоянии вырастить большую часть помета. При этом помимо кормления молоком самка способна вылизывать детенышей, однако ни строить гнездо, ни подтаскивать их к нему она не может. Было также показано, что при мутации sg изменены уровни лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в плазме крови (Guastavino et al., 1992).

Плавание.При некоторых неврологических мутациях, затрагивающих внутреннее ухо и органы равновесия, эта способность полностью отсутствует, тогда как у мозжечковых мутантов плавание нарушено меньше, чем ходьба. Возможно, что этот тип локомоции, как более древний и более примитивный, базируется на более простых, а следовательно, менее затронутых анатомическими аномалиями сетях нейронов.

Исследовательское поведение.При мутации nervous (nv), повреждающей клетки Пуркинье мозжечка и его центральные ядра, исследовательское поведение изменяется незначительно. Число норковых реакций (заглядываний в отверстия, проделанные в полу камеры) не отличается от нормы. В то же время nv и другие мутанты характеризуются персеверацией реакций, т.е. повторным обследованием одних и тех участков пространства (отверстий-норок). По сравнению с нормальными животными у мутантов резко ослаблен процесс привыкания исследовательского поведения, иными словами, у них нарушен один из наиболее универсальных процессов адаптации к внешним условиям. Следует, однако, помнить, что причиной сильных аномалий исследовательского поведения этих мутантов может быть, по крайней мере частично, измененная моторика.

Реакция чередования.Попеременное перемещение то вправо, то влево при обследовании пространства, при поисковом поведении, при помещении в достаточно знакомую обстановку – характерная черта лабораторных мышей и крыс. У мутантов sg эта способность полностью отсутствует.

Аналогичный дефект отмечен у мутантов rl, wv и при мутации purkinje cell degeneration (pcd). Полагают, что данное нарушение есть следствие аномалий в анатомии и/или нейрохимии гиппокампа.

Обучение в лабиринте; пространственная память.Аномальное строение гиппокампа с нарушением расположения слоев при мутации Hippocampal lamination defect (Hid), свойственное линии BALB/с, выявляется только гистологически, а специфических изменений поведения, характерных для данной мутации, не описано. При мутации rl нарушаются некоторые виды поведения. При мутации НШ обучение реакции пассивного избегания не страдает, но оно резко изменено у rl, у которой были нарушены даже начальные этапы формирования навыка поиска пищи в радиальном лабиринте. Несмотря на фенотипическое сходство особенностей поведения мутантов rl и sg, аномалии поведения в радиальном лабиринте и в водном лабиринте Морриса были более сильными у rl.

8.6.4.4. ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕДЕНИЯ МЫШЕЙ-"НОКАУТОВ".

Развитие генной инженерии и молекулярной биологии сделало возможным получение так называемых трансгенных животных, упоминавшихся в разделах 8.5.3.2 и 8.6.3.3. Напомним, что в геном животного (в настоящее время используются почти исключительно мыши) вводится новый генетический материал – это может быть или участок ДНК, кодирующий измененный ген, уже имеющийся у реципиента, или ген от животного другого вида, например крысы. Выделенный фрагмент ДНК вводится в геном реципиента (точнее, в его зародыш) разными способами. Во-первых, можно произвести прямую инъекцию ДНК в оплодотворенную яйцеклетку. Во-вторых, используя вектор ретровируса, можно ввести ДНК в развивающийся эмбрион, причем наиболее эффективно введение на стадии морулы. Третий способ – это введение в бластоцисту стволовых эмбриональных клеток (с измененным геномом).

Специальные молекулярно-биологические методы обеспечивают достаточно надежную экспрессию новой ДНК в геноме реципиента, иначе введенный в геном фрагмент может сохраняться в латентном виде, не обнаруживая себя (Crenshow et al., 1992).

Как и при работе с химерными животными, для успешного исследования трансгенного организма необходимо уметь четко идентифицировать, у кого именно из мышей данного помета генотип имеет новый, необычный ген. Для этого важно найти надежные маркеры – либо биохимические, либо молекулярно-биологические. Иногда носители такого нового гена внешне отличаются от нормальных собратьев.

Эксперименты по введению фрагмента ДНК с делецией по гену, кодирующему белок CREB, были упомянуты выше (см.: 8.6.3.3).

Интересные результаты дали исследования мышей с мутантным, т.е. дефектным геном, кодирующим дофаминовый рецептор D-1. Животные с таким дефектом развиваются с задержкой и погибают, когда прекращается материнское вскармливание. Однако они успешно выживают, если их перевести на искусственное вскармливание жидкой пищей. У этих животных вполне нормальная координация движений, хотя при исследовательском поведении у них меньше "стоек", чем у нормальных животных тех же пометов. В нейронах стриатума у них нет связывания веществ-лигандов, специфичных для D-1 рецепторов, хотя нейроны, на которых такие рецепторы находятся в норме, у мышей-нокаутов есть и сохраняются вплоть до взрослого состояния.

Размер мозга у мышей-нокаутов был несколько меньше, однако общее анатомическое строение мозга не менялось. Особенности были отмечены в цитоархитектонике и нейрохимии стриатума, а также в некоторых физиологических реакциях. Каждый из двух структурных компонентов полосатого тела – стриосомы и матрикс (см.: Groves, 1983; White, 1989) – у мутантных мышей имел свои, отличные от нормы особенности. В матриксе наиболее заметным признаком было резкое снижение числа клеток, иммунореактивных к динорфину. В системе стриосом снижалось специфическое окрашивание, которое свидетельствовало об изменениях в содержании опиоидных пептидов. Наиболее интересной особенностью поведения мышей, лишенных рецепторов класса D-1, было отсутствие активирующего эффекта введения кокаина. Можно ожидать, что этот объект станет перспективной моделью для выяснения механизмов влияния наркотических веществ на мозг.

Анализ работы мозга и особенностей поведения трансгенных животных ставит перед исследователями вопрос, уже не раз подни-мавшйся в связи с анализом эффекта мутаций. Мутация данного гена может влиять на мозг и поведение не только в связи с выключением его специфической функции, но и потому, что собственно формирование структуры мозга (в данном примере – стриатума) в процессе нейрогенеза у таких мышей также может происходить аномально. Возвращаясь к терминологии классической генетики, мы пока не знаем, в чем заключаются плейотропные эффекты "трансгенной" мутации.

Тем не менее, метод создания трансгенных животных дает ценнейшие данные о специфических функциях тех или иных генов, например в процессе развития мозга, поэтому список линий мышей с измененными генами, а также мышей-нокаутов быстро пополняется. В ряде случаев создание подобных моделей необходимо для практических целей, например для создания мышей без нуклеотид-ной последовательности, кодирующей так называемый прионный белок. Как известно, молекулы этого белка считаются инфекционным началом особой группы нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни овец – скрэпи, от которой ежегодно погибают тысячи животных. В связи с этим практическая задача состоит в создании овец-нокаутов. В качестве первого этапа этого исследования были получены мыши-нокауты по гену прионного белка. Они вполне жизнеспособны и внешне не отличаются от обычных. В пределах нормы сохраняется также обучение пространственному навыку – ориентации в водном лабиринте Морриса.

Были также получены мыши с полностью выключенной функцией гена Dvll (одного из трех генов мыши, гомологичных гену полярности сегментов дрозофилы). Животные оказались жизнеспособными, фертильными, у них не было морфологических отклонений в мозге, но отмечались некоторые особенности поведения и физиологии. Во-первых, это была аномалия организации сенсорного притока (gating) в слуховом и тактильном анализаторе. Во-вторых, неожиданно выяснилось, что для них было характерно снижение социальных контактов. Это произошло следующим образом.

Отличительная особенность поведения мышей линии 129/SvSv – это "подстригание усов (вибрисс)" соседям по клетке, так что по достижении взрослого состояния значительный процент животных оказывается лишенным вибрисс (такое поведение описано у самцов и самок нескольких инбредных линий мышей). Гомозиготные мыши-нокауты по упомянутому гену сохраняли свои усы в целости, что было причинно связано с резким уменьшением социальных контактов между этими животными. У них было нарушено и гнез-достроительное поведение.

Особенности поведения (а также нейрохимической и морфологической организации мозга) мышей разных инбредных линий следует учитывать при оценке эффектов искусственных "генноинженер-ных" мутаций. Целый ряд досадных ошибок в выборе "фоновой" линии заставил специалистов, работающих в этой области, провести подробный анализ данных и выработать рекомендации по предпочтительному, наиболее информативному использованию той или иной линии при мутационном вмешательстве в какую-либо из систем мозга.