Техника замораживания

Существуют два альтернативных метода заморозки — ручная (статический протокол) и автоматическая (динамический протокол). Доля глицерина в составе разбавителя зависит от применяемого метода. При ручной заморозке используют контейнер (30 х 40 х 30 см) из полистирола со съемной металлической полкой, помещенной на 10 см ниже края. Контейнер заполняют жидким азотом до уровня, находящегося на 4 см ниже полки.

Заполненные соломки (8–10 максимально) захватывают пинцетом, помещают горизонтально на полку и оставляют в испаряющемся азоте на 8 минут. Затем пинцет охлаждают в жидком азоте, приподнимают и поворачивают с его помощью пайетты, одну за другой, чтобы удостовериться в полной кристаллизации их содержимого. После этого пайетты погружают в жидкий азот. Такую процедуру называют статической в связи с присутствием постоянного нерегулируемого потока испаряющегося азота в период охлаждения и заморозки.

Автоматическая заморозка подразумевает использование машины. Такой способ называют динамическим, поскольку испаряющийся азот поступает в морозильную камеру с различной скоростью в зависимости от заданной программы, позволяющей регулировать темпы заморозки. Программа заморозки осуществляется автоматом Planer 10™, разработанным Hofmo (1988) для замораживания спермы лисиц. В настоящее время этот прибор используется в лаборатории автора, располагающей обширным запасом образцов спермы. Пайетты замораживают в горизонтальном положении на полке со съемной крышкой, причем в морозильной камере может находиться несколько таких полок. Программа заморозки включает следующие режимы:

• -2 ºС/мин. начиная с +4 °C до -7 °C;

• -50 ºС/мин. от -7 °C до -100 °C;

• -25 ºС/мин. от -100 ºС до -180 °C.

после окончания процедуры полку помещают непосредственно в жидкий азот.

Размораживание

Пайеггы размораживают на водяной бане (в термосе) при температуре 70 ºС в течение 8 секунд. После размораживания их ставят вертикально фильтром вниз, распечатывают крышку, встряхивают, чтобы пузырек воздуха мог подняться вверх. Соломку вскрывают и несколько капель образца помещают на подогретое предметное стекло для оценки параметров спермы после размораживания. До восстановления подвижности сперматозоидов проходит некоторое время, обычно 2 минут бывает достаточно. В связи с тем, что разные лаборатории используют различные техники замораживания, при размораживании образца спермы, полученного из какой-то определенной лаборатории, необходимо строго соблюдать все полученные оттуда рекомендации, поскольку процессы замораживания и размораживания тесно связаны между собой.