Общие методы выделения

Центрифугирование – один из простейших и наиболее важных методов разделения малых и больших молекул [20]. Этот метод основан на законе Стокса для шарообразных частиц, согласно которому скорость оседания V прямо пропорциональна квадрату радиуса частиц r² и разности плотностей (d_р – d_т) осаждающихся частиц d_р и среды d_т и обратно пропорциональна вязкости среды h:

V = Kr²g(d_р – d_m)/ h

где К – фактор формы частиц (для шара 0,222).

Центрифуга может быть использована как для простого разделения, т. е. для осаждения или флотации только одного компонента, так и для фракционирования. В последнем случае процесс называется фракционным или дифференциальным центрифугированием. Различные компоненты системы разделяются при центрифугировании на различных скоростях. Такие крупные ингредиенты, как клетки или клеточные фрагменты, оседают первыми, т. е. при относительно низкой скорости центрифугирования, равной 3000 – 4000 об/мин. Препаративное разделение макромолекулярных веществ из раствора может быть достигнуто только при помощи ультрацентрифуги, в которой макромолекулы подвергаются воздействию сил тяжести, превышающих нормальную силу тяжести в 100000 раз и более [21]. Очень большие компоненты, например многие вирусы и высокомолекулярные гликогены, могут осаждаться центрифугированием при 10000 – 15000 об/мин. Макромолекулы среднего размера при более высоких скоростях, порядка 30000 – 40000 об/мин, осаждаются медленно.

Следует, однако, подчеркнуть, что существуют определенные ограничения возможностей разделения при помощи этого метода. Относительно хорошее разделение возможно лишь в том случае, если компоненты значительно различаются размерами своих частиц, молекулярными массами или плотностями. Сложные смеси, состоящие из многих компонентов, например сыворотка крови, таким путем хорошо не разделяются. То же справедливо для полидисперсных смесей крахмала или гликогена: наиболее тяжелые фракции осядут первыми, но они не будут однородными. Особенно трудно разделение линейных макромолекул, так как осажденные частицы перепутываются, осажденный материал здесь напоминает гель, удерживающий наиболее легкие компоненты, которые нужно отделить.

Фильтрование, ультрафильтрование, диализ и аналогичные методы[22]. Эти методы можно иллюстрировать на примере просеивания частиц через сита. Следует заметить, что поры в фильтровальной бумаге гораздо меньше и менее однородны, чем отверстия в сите. Обычные материалы, используемые для фильтрования, например, бумажная ткань, фильтровальная бумага или стеклянная вата, имеют неоднородные отверстия, и такие фильтрующие средства характеризуются определенными порами среднего размера. Очень удобны туфовые стеклянные фильтры разных размеров, имеющие различные средние диаметры пор. Для очистки применяют препараты из кизельгура. Слой такого материала можно получить фильтрованием суспензии через туфовый стеклянный фильтр при пониженном давлении. Для тех же целей можно использовать тонкоизмельченный уголь или бумажную массу.

В различных грубых фильтрующих средствах размер пор среднего диаметра варьирует между 0,01 – 0,05 мм, в то время как тонкие фильтры задерживают частицы, имеющие размер приблизительно 0,001 мм.Коллоидные частицы и макромолекулы такими обычными фильтрами не задерживаются, но их частичное фракционирование может быть достигнуто при помощи ультрафильтров. Последние представляют собой гель, обладающий чрезвычайно тонкими каналами или капиллярами, проницаемыми лишь для малых молекул. Наиболее обычными материалами для ультрафильтрования являются целлофан и нитроцеллюлоза (коллодий). Средний размер пор этих ультрафильтров может варьировать в пределах 0,01 – 1 мк. «Твердые» ультрафильтры с размером пор 0,01 – 0,02 мкзадерживают как очень большие, так и средние макромолекулы, «мягкие» же ультрафильтры со средним диаметром пор 0,05 – 0,1 мкзадерживают только наиболее крупные компоненты.

Диализявляется очень важной процедурой в выделении и очистке макромолекулярных соединений. Для этой цели очень удобны целлофановые стаканы. Если раствор высокомолекулярного соединения налить в такой стакан, а стакан погрузить в сосуд с водой, через мембрану будет происходить обмен компонентов. Присутствующие в растворе микромолекулярные примеси будут проходить через целлофан в воду, в то время как часть воды пройдет в стакан. При этом макромолекулы больших и средних размеров останутся внутри стакана. Только самые маленькие из макромолекул, такие как макромолекулы лизоцима, очень медленно проходят через обычную целлофановую мембрану [23]. Диализ используется главным образом для освобождения растворов макромолекулярных соединений от электролитов, например от ионов натрия, сульфата, аммония, хлорида и других ионов, и микромолекулярных неэлектролитов, таких как сахар, мочевина, спирт и т. д. Скорость диализа может быть увеличена перемешиванием и непрерывной сменой воды в наружном сосуде. Облегчает диализ также нагревание, хотя его обычно избегают из-за нестойкости макромолекул, т. е. их возможной денатурации при нагревании. Удаление малых ионов производится также электродиализом. Постоянный ток пропускают через раствор, отделенный от воды полупроницаемыми мембранами.

Фракционное осаждение и экстракция.Эти методы применяются для выделения и очистки всех природных высокомолекулярных соединений. Экстракция может быть использована для двух основных целей: удаления нежелательных примесей и получения некоторого количества высокомолекулярного соединения из твердого исходного материала. Жиры и другие микромолекулярные липиды – наиболее обычные примеси, которые удаляются экстракцией растворителями, не смешивающимися с водой. Однако такие экстракты никогда не бывают чистыми, и их дальнейшая очистка достигается центрифугированием, фильтрованием, осаждением и т. д. Лишь такие грубые примеси, как фрагменты клеток, могут быть удалены центрифугированием и фильтрованием, в то время как микромолекулярные загрязнения устраняются диализом. Остаток, получаемый при этом, обычно представляет собой смесь макромолекул, которая может быть фракционирована более или менее полно путем фракционного осаждения. При фракционировании природных высокомолекулярных соединений используются многие осадители – соли, кислоты, щелочи, спирты, ацетон и т. д. Сульфат аммония, например, рекомендуется для фракционирования белков [24], что обусловлено его высокой растворимостью и способностью осаждать многие белки. Метиловый, этиловый, пропиловый спирты и ацетон служат обычными осадителями как для белков, так и для полисахаридов. Очень часто органические осадители для индивидуального высокомолекулярного соединения используются вместе с некоторыми буферными растворами с определенной величиной рН и определенной ионной силой. Во избежание денатурации такое осаждение обычно проводят при низких температурах (от -5 до 0°С).

Хроматографические методы.Известно несколько типов хроматографических исследований, которые можно разделить на три основные группы, учитывая явления, лежащие в их основе: это – распределение, адсорбция - десорбция и ионный обмен.

В распределительной хроматографии вещества распределяются между двумя несмешивающимися жидкостями благодаря их растворимости в этих средах. Когда между жидкостями без твердой фазы происходит повторное распределение, этот метод называется противоточным распределением. Однако одна из жидких фаз здесь удерживается твердым пористым веществом, которое обычно помещается в вертикальную трубку, а другая жидкость может проходить через колонку сверху вниз. Распределительная хроматография очень эффективна при разделении многих низкомолекулярных веществ, но ее использование для разделения высокомолекулярных веществ ограничено. Однако некоторые белки были успешно разделены этим методом, особенно при предотвращении денатурации на поверхности раздела фаз [25].

Адсорбционная хроматография – первоначальная модификация хроматографии, разработанная еще в 1906 г. русским ученым Цветом, основана на том, что некоторое количество адсорбента, например тонкоизмельченного пористого вещества, имеет неодинаковое сродство к различным веществам. Адсорбция или сорбция обусловливают слабую связь вещества с поверхностью. Для определенных адсорбента и адсорбируемого вещества количество последнего зависит от величины поверхности, концентрации и температуры. Поскольку площадь поверхности зависит от степени измельчения, то чем мельче порошок, тем больше его адсорбционная способность. Кроме того, адсорбция облегчается понижением температуры и происходит полнее в случае разбавленных растворов.

Когда в растворе присутствует несколько веществ, они конкурируют со свободными поверхностями и вещество с самым большим сродством к адсорбенту будет адсорбироваться первым. Если смесь поместить в верхней части колонки, содержащей адсорбент, то первый компонент останется в верхней зоне. Следующим будет адсорбироваться компонент с меньшим сродством к поверхности адсорбента, а некоторые компоненты будут проходить через колонку, совсем не адсорбируясь на ней.

Адсорбированные компоненты можно разделить после того, как из трубки извлечена колонка адсорбента. Ее делят на зоны и элюируют адсорбированные вещества подходящими растворителями. Во многих случаях возможно и прямое элюирование без извлечения адсорбента из трубки. При этом подаваемый сверху растворитель в первую очередь будет вымывать наименее адсорбированный компонент. Вытекающая снизу жидкость собирается в пробирки с помощью фракционного коллектора.

Если вещество, подлежащее разделению, бесцветно, его анализируют путем отбора небольших проб из каждой пробирки и их определением посредством известных аналитических методов (например, спектрофотомерии); затем содержимое пробирок объединяют и выделяют вещество. Если элюат содержит несколько компонентов, то они все будут находиться в разных пробирках.

Адсорбционно-десорбционные методы можно использовать и без применения колонки и последующего элюирования. Например, хорошо известным средством для освобождения растворов различных органических веществ от окрашенных примесей является тонкоизмельченный уголь.

Ионообменная хроматография. Разделение на поверхности ионизированных твердых веществ в настоящее время является наиболее важным методом выделения и очистки высокомолекулярных соединений, поскольку оказалось, что адсорбция очень часто ассоциируется с ионным обменом. Техника ионообменной хроматографии сделалась популярной после введения в практику синтетических смол (дауэкс, кальцит, амберлит, КУ-1, КУ-2, СУ). Эти ионообменники представляют собой полимеры с трехмерной структурой, т. е. длинные макромолекулярные цепи присоединены поперечными связями к нерастворимой сетке или решетке адсорбента, содержащей такие диссоциирующие группы, как - SО₃Н, - СООН или - NН₂. Эти смолы подразделяются на смолы кислые – катионообменныеи основные – анионообменные. Очень важным для ионного обмена является также количество ионогенных групп на единицу массы, так как ионы на поверхности частиц представляют активные участки. Наконец, ввиду того что во многих случаях известную роль играет и адсорбция на поверхностях, важное значение имеют также химические свойства решетки.

На активных участках смолы происходят следующие обменные реакции:

- катионный обмен: RSО₃Н + Саt⁺ = RSО₃Саt + Н⁺

RСООН + Саt⁺ = RСООСаt + Н⁺

- анионный обмен: RNH₃ОН + Аn^- = RNH₃Аn + ОН^-

RN(СН₃)₂(СН₂СН₂ОН)ОН + Аn^- =

= RN(СН₃)₂(СН₂СН₂ОН)Аn + ОН^-

Исходная кислотная или основная смола сначала нейтрализуется, а затем применяется для обмена, например:

RСОONa + Саt⁺ = RСООСаt + Nа⁺

или RNH₃Cl + An^- = RNH₃An + Cl^-

Поскольку значительная часть природных органических макромолекул представляет собой большие поливалентные анионы, содержащие такие активные группы, как карбоксильные, фосфатные или сульфатные, для разделения природных высокомолекулярных соединений наиболее важны анионообменные, а не катионообменные реакции. В случае таких амфотерных макромолекул, как белковые, последние будут связываться катионообменной смолой при значении рН ниже изоэлектрической точки, т. е. в более или менее сильнокислой среде. Очевидно, что как связывание отдельного компонента в ионообменной колонке, так и его элюирование должны зависеть от кислотности растворов, используемых для обработки. Важна также ионная сила буфера, употребляемого для элюирования. Это объясняется тем, что диссоциация смолоподобного полимера облегчается при высокой ионной силе.

В настоящее время ионообменная хроматография успешно применяется не только для разделения макромолекулярных смесей, но и для деионизации таких растворов. В основу этого процесса положены принципы удаления солей из воды. Смесь анионо- и катионообменных смол помещают в трубку, через которую сверху пропускают раствор. При этом все анионы связываются анионными участками анионообменника, а катионы - катионными участками катионообменника; эквивалентное количество освобожденных ионов ОН^- и Н⁺ соединяется, образуя воду. Неионогенные макромолекулы через колонку проходят свободно. Изготовляются многослойные смешанные ионообменные колонки, которые можно также использовать для деионизации белков. С их помощью, например, сывороточный альбумин освобождается от последних следов электролитов значительно полнее, чем при электродиализе [26].

Разделение путем электрофореза.Заряженные макромолекулы, например, белков, нуклеиновых кислот, пектинов и некоторых других полисахаридов мигрируют под влиянием электрического тока. Скорость электрофореза зависит от числа заряженных единиц, которые несет частица, например молекула белка. Белки, содержащие большое число свободных карбоксильных групп, будут передвигаться к положительному полюсу быстрее, чем белки с меньшим содержанием этих групп [17].