Методы определения параметров токсикометрии

В зависимости от цели токсиикометрические исследования проводятся по-разному, но для решения задач гигиенической регламентации методические приемы, условия проведения и оценка результатов унифицированы.

Исследование токсичности веществ начинается с изучения смертельных эффектов в острых опытах. Проникновение веществ в организм осуществляется при вдыхании (ингаляционный путь), введении в желудок, нанесении на кожные покровы и слизистые оболочки. Для изучения сравнительной токсичности соединение вводится внутрибрюшинно. В опытах на животных (белые крысы массой 180–240 г, белые мыши массой 18–29 г) определяют концентрацию (дозу), вызывающую гибель 50 % стандартной группы подопытных животных. CL₅₀ и DL₅₀ являются статистическими величинами со средней ошибкой и доверительными интервалами. В связи с этим в каждой группе количество животных должно быть не менее 6, желательно обоего пола и двух видов. Токсичность вводимого вещества в известной степени зависит от ряда факторов (концентрации и объема вводимого вещества, рН, температуры окружающей среды и др.). Поэтому каждый путь поступления соединений в организм требует определенных условий.

При оценке степени токсичности приэнтеральном пути поступлениянаиболее часто вещество вводится непосредственно в желудок с помощью металлических или пластмассовых зондов. Введение соединений производится через 3 ч после кормления, вводимый объем не должен превышать для мышей 1 мл, для крыс – 5 мл. Кормление животных осуществляется через 3 ч после введения вещества. Изучаемое соединение вводится в чистом виде. Если это невозможно, то используются растворители. Обычно такие вещества вводятся в водных растворах, плохо растворимые соединения – в растительном масле, в виде суспензии в 1–2 %-м растворе крахмала. Следует помнить, что острая токсичность может существенно меняться в зависимости от используемого растворителя. Поэтому используемый растворитель обязательно вводится контрольной группе животных.

Поступление вредных химических веществ через дыхательные пути в производственных условиях играет ведущую роль в возникновении профессиональных заболеваний (отравлений). В лабораторных условиях используются два способа ингаляционного воздействия на лабораторных животных химическими веществами – статический и динамический.

Статический способ используется для ориентировочных оценок степени токсичности летучих веществ при создании постоянной концентрации в замкнутом пространстве (специальные камеры или эксикаторы). Срок экспозиции для мышей – 2 ч, для крыс, морских свинок, кроликов – 4 ч. Основными недостатками данного метода являются быстрое накопление в невентилируемом пространстве углекислого газа, трудности в поддержании концентрации в камере на расчетном уровне.

Динамический способ позволяет обеспечить непрерывную подачу вещества в камеру, что создает условия для поддержания концентрации соединения на относительно постоянном уровне и обеспечивает необходимый воздухообмен.

Наряду с определением параметров токсикометрии на смертельном уровне, позволяющем определить токсичность и опасность вещества, установить видовую и половую чувствительность, большое прикладное значение имеют такие параметры острой токсичности, как пороги вредного воздействия при однократном поступлении по интегральным (неспецифическим) и специфическим показателям (Lim_{ac int} иLim _{ac sp}).

Определение порога острого действия при однократном воздействии по изменению интегральных показателей проводится с использованием не менее 12 мелких лабораторных животных на одну концентрацию (дозу), как правило, применяется не менее трех концентраций. Оценка функционального состояния экспериментальных животных проводится через 4 ч после затравки, а затем на 2-й, 4-й и 8-й день опыта. При этом учитываются максимальные отклонения величины исследуемого показателя. Определение порога вредного действия по большинству специфических показателей регламентируется методическими указаниями, утвержденными Минздравом России.

В производственных условиях наряду с энтеральным и ингаляционным путями возможно поступление химических веществ через кожные покровы – перкутантный путь.В практическом плане большое значение имеет определение кожно-резорбтивного и раздражающего действия. Предварительная оценка кожно-резорбтивного действияпроизводится на мелких лабораторных животных путем погружения хвоста на 2/3 длины в исследуемый раствор. Экспозиция для белых мышей – 2 ч, крыс – 4 ч. При отсутствии симптомов интоксикации аппликации веществ продолжаются в течение 10 дней с последующим наблюдением на протяжении 3-х недель. При наличии резорбтивного действия производится количественная оценка степени токсичности. С этой целью животные фиксируются на специальном станке и на заранее выстриженный участок кожи наносят исследуемое соединение в определенной дозе. В зависимости от поставленной задачи при исследовании кожно-резорбтивного действия могут быть определены средняя смертельная концентрация или величина порога.

Исследование местного раздражающего действия при аппликации на кожу проводится на двух видах экспериментальных животных. Используются кролики и морские свинки светлой масти.

Количество животных – не менее 10 особей в группе. Участок аппликации составляет для кроликов 7 ´ 9 см, для морских свинок 5 ´ 5 см. За два дня до эксперимента тщательно выстригают участки шерсти по обе стороны от позвоночника, оставляя шерстяной покров между участками шириной 2 см. Правый бок служит для аппликации, левый – для контроля. На время экспозиции животных фиксируют для исключения слизывания вещества с кожи. Время экспозиции – 4 ч. Исследуемое вещество наносится на кожу из расчета 20 мг/см². Как правило, соединение наносят на кожу в чистом виде. Если это невозможно, то используют дистиллированную воду или модельную среду, имитирующую состав потовой жидкости. Оставшееся после окончания эксперимента вещество удаляется теплой водой с мылом. Реакцию кожи регистрируют через 1 и 15 ч после однократной аппликации. Функциональные нарушения кожи характеризуются появлением выраженных в разной степени эритемы, отека, трещин, изъязвлений, а также изменением температуры кожи. Степень выраженности раздражающего действия вещества на кожные покровы определяют по классификации, включающей 11 классов (0 – отсутствие действия, 10 – растворы вещества слабее 5 % вызывают некроз).

Исследование местного действия вещества на слизистую оболочку глаза проводится при закапывании в конъюктивальный мешок 1 капли соединения. Твердые вещества вносят в количестве 50 мг (дисперсность частиц до 10 мкм). В дальнейшем в течение двух часов наблюдают за прозрачностью роговицы и слизистой оболочки. Развитие помутнения роговицы, острое воспаление слизистой оболочки с последующим рубцеванием век свидетельствует о наличии у вещества резко выраженного раздражающего эффекта.

В условиях подострого (на протяжении месяца) эксперимента проводят исследования, направленные на выявление наиболее чувствительных к воздействию токсичных веществ органов и систем экспериментальных животных. Это позволяет более адекватно подойти к выбору концентраций при проведении хронического эксперимента. Опасность токсичных веществ для человека в значительной мере предопределяется их способностью к кумуляции, поэтому изучение кумуляции является обязательным условием при гигиеническом регламентировании химических соединений. Наиболее распространенные в промышленной токсикологии методы оценки кумуляции основаны на определении усредненного суммарного количества вещества, полученного животным до появления определенного эффекта в подостром опыте, и сопоставлении этого количества с однократной средней эффективной дозой.

В настоящее время в токсикологии принято несколько методов оценки кумуляции. С помощью метода, предложенного Каганом, животным ежедневно вводят вещество в долях от установленной DL₅₀ (1/5, 1/10, 1/20, 1/200). Данный метод позволяет прогнозировать опасность развития хронического отравления. Опыт по развернутой схеме продолжается 4 месяца. Более быстрым является тест «субхронической интоксикации».Тест проводится в течение 24 дней. Первоначально ежедневная доза, составляющая 0,1 от установленной ранее DL₅₀,вводится в течение первых четырех дней. На пятые сутки дозу повышают в 1,5 раза и вводят еще в течение четырех дней и так далее. Затем определяют С_cum.

Более полная информация о кумулятивной активности соединений, развитии хронической интоксикации при воздействии химических веществ может быть получена при постановке длительных экспериментов.

Целью хронического(5-месячного эксперимента) является изучение характера влияния на организм вредных веществ и установление Lim _ch.

Исследование хронического действия проводится на одинаковых по количеству опытных группах с соответствующим контролем. Опыты проводят на белых крысах, а при выраженных межвидовых различиях и на более чувствительном виде животных. Воздействие соединением осуществляется 4 ч в день 5 раз в неделю на протяжении четырех месяцев; пятый месяц – период восстановления. Как правило, проводится исследование трех концентраций с установлением пороговой и недействующей. В зависимости от типа действия вещества применяют комплекс функциональных, биохимических, морфологических и других показателей. Каждый показатель исследуют не менее чем на 12 животных. Оценка состояния экспериментальных животных проводится в динамике: первое обследование – через 2 недели, далее – ежемесячно.