Методы разделения белков по биологической активности

Способность белков избирательно взаимодействовать с определёнными лигандами составляет основу метода аффинной или биоспецифической хроматографии.

Рисунок 4.8. Разделение пептидов методом аффинной хроматографии

Достоинством этого метода очистки является то, что он позволяет избирательно извлекать из сложной смеси белков один конкретный белок или по крайней мере небольшое их число. Метод основан на использовании иммобилизованного лиганда, который специфически взаимодействует с тем белком, который требуется получить в очищенном виде. Из всех белков, присутствующих в смеси, с этим иммобилизованным лигандом связываются только те белки, которые способны вступать с ним в сильное взаимодействие. После удаления всех прочих несвязавшихся белков нужный фермент элюируют с иммобилизованного лиганда либо концентрированными солевыми растворами, либо раствором, содержащим растворимую форму лиганда (рисунок 4.8). Применение метода аффинной хроматографии позволяет добиться в ходе очистки результатов, обычно превосходящих результаты последовательного применения многочисленных классических методов.

Как известно, ферменты обладают высокой специфичностью по отношению к своим субстратам и коферментам, поэтому наиболее подходящими лигандами служат производные субстратов и коферментов, ковалентно связанные с носителем, например с сефадексом. Они могут быть присоединены к носителю либо непосредственно, либо через связующую «ножку» (линкер) из 3—8 атомов углерода.

Примером успешного применения аффинной хроматографии может служить очистка множества различных дегидрогеназ на аффинных носителях с НАД⁺ в качестве лиганда. При этом с лигандом могут связываться несколько дегидрогеназ, которые при элюировании их раствором НАД⁺ выходят вместе, и их дальнейшее разделение проводят, используя уже не коферментные, а субстратные аффинные носители.

С аффинной хроматографией во многом сходна хроматография, при которой в качестве лигандов используются красители (голубая, зеленая или красная сефароза), а также хроматография на гидрофобных лигандах, где носителем является октил- или фенилсефароза. В первом случае в качестве иммобилизованного лиганда используют органический краситель, являющийся аналогом субстрата, кофермента или аллостерического эффектора. Элюирование обычно осуществляют солевым раствором увеличивающейся концентрации.