Введение в молекулярную биологию. Введение в изучение клеточной и молекулярной биологии 5 страница

• Наружный листок нуклеолеммы со стороны гиалоплазмы окружен сетью виментиновых промежуточных филаментов и имеет на своей поверхности свободные рибосомы, прикрепленные к ней большими субъединицами.

• Внутренний листок — гладкий, не содержит рибосом, образует связи с пластинкой (ламиной) ядра и участвует в фиксации интерфазных хромосом.

• Листки нуклеолеммы выполняют по отношению к ядру две важные функции — формообразовательную и рецепторно-барьерно-транспортную.

Перинуклеарное пространство:

• Перинуклеарное пространство прерывается множеством пор. Они представляют собой сквозные туннели, сообщающие содержимое ядра и гиалоплазмы. Стенка пор образована слившимися листками нуклеолеммы. В области пор отсутствует гетерохроматин.

• Диаметр ядерных пор — около 90 нм, а численность варьирует в зависимости от активности биосинтетических процессов в клетке.

• Поровые туннели заполнены поровыми комплексами, состоящими из трех компонентов: поровых колец, центральных спиц и центральной гранулы. Все компоненты порового комплекса — белковые производные, обеспечивающие строго избирательный транспорт мак ромолекул в ядро и из ядра.

Ядерная пластинка (ламина):

• Внутренняя ядерная мембрана связана с тонким волокнистым белковым слоем — ядерной ламиной, состоящей из белков ламинов, относящихся к полипептидам, образующим промежуточные 10-нм филаменты цитоплазмы.

• Густая сеть фибрилл ядерной ламины способна обеспечить целостность ядра, даже после растворения фосфолипидных мембран оболочки ядра в эксперименте. С внутренней стороны к ламине крепятся петли хроматина, заполняющего ядро.

Транспорт цитоплазма↔ядро:

• В процессе ядерно-цитоплазматического транспорта ядерная оболочка функционирует как некое молекулярное сито, пропуская ионы и мелкие молекулы (сахара, нуклеотиды, АТФ и др.) пассивно, по градиенту концентрации, и осуществляя активный избирательный транспорт крупных молекул белков и рибонуклеопротеидов, то есть комплексов рибонуклеиновых кислот (РНК) с белками. Для этого существует комплекс ядерной поры.

• Так, например, белки, транспортируемые в ядро из цитоплазмы, где они синтезируются, должны иметь определенные последовательности примерно из 50 аминокислот, (NLS последовательности), «узнаваемые» комплексом ядерной поры. В этом случае комплекс ядерной поры, затрачивая энергию в виде АТФ, активно транслоцирует белок из цитоплазмы в ядро.

• Клетка HeLa имеет 10 млн рибосом, для ее роста необходимо импортировать в ядро 560000 рибосомальных белков и экспортировать 14000 рибосомальных субъединиц за каждую минуту.

Ядерные поры:

• Ядерная оболочка имеет отверстия диаметром около 90 нм, образующиеся за счет слияния внешней и внутренней ядерных мембран. Такие отверстия в оболочке ядра окружены сложными белковыми структурами, получившими название комплекса ядерной поры.

• Восемь белковых субъединиц, входящих в состав ядерной поры, располагаются вокруг перфорации ядерной оболочки в виде колец, диаметром около120 нм, наблюдаемых в электронный микроскоп с обеих сторон ядерной оболочки.

• Белковые субъединицы комплекса поры имеют выросты, направленные к центру поры, где иногда видна «центральная гранула» диаметром 10-40 нм.

• Размер ядерных пор и их структура стандартны для всех клеток эукариот. Число ядерных пор зависит от метаболической активности клеток: чем выше уровень синтетических процессов в клетке, тем больше пор на единицу площади поверхности клеточного ядра.

Импорт белков из цитоплазмы в ядро: 1) NLS+рецептор импортин α/b связывается с цитоплазматическим филаментом; 2-3) перенос в ядро; 4) при взаимодействии с Ran-ГТФ комплекс диссоциирует, переносимый белок остается в ядре, а Ran-ГДФ+импортин-b и импортин-α возвращаются в цитозоль

Экспорт мРНК из ядра: 1)пре-мРНК содержит 3 экзона и 2 интрона; 2) сплайсинг с участием белков EJC и Aly; 3) связь с белком TAP обеспечивает перенос через пору; 4) в цитоплазме вспомогательные белки отщепляются и мРНК готова к трансляции

Эухроматин и гетерохроматин:

• Хроматин интерфазных ядер представляет собой хромосомы, которые, однако, теряют в это время свою компактную форму, разрыхляются, деконденсируются. Степень такой деконденсации хромосом может быть различной.

• Зоны полной деконденсации их участков морфологи называют эухроматином. При неполном разрыхлении хромосом в интерфазном ядре видны участки конденсированного хроматина, иногда называемого гетерохроматином.

• Степень деконденсации хромосомного материала — хроматина в интерфазе может отражать функциональную нагрузку этой структуры. Чем «диффузнее» распределен хроматин в интерфазном ядре (т.е. чем больше эухроматина), тем интенсивнее в нем синтетические процессы.

Хроматин - функции

• Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде плотных хромосом. В этот период хромосомы не выполняют никаких синтетических функций, в них не происходит включения предшественников ДНК и РНК.

• Таким образом, хромосомы клеток могут находиться в двух структурно-функциональных состояниях: в активном, рабочем, частично или полностью деконденсированном, когда с их участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и редупликации, и в неактивном, в состоянии метаболического покоя при максимальной их конденсированности, когда они выполняют функцию распределения и переноса генетического материала в дочерние клетки.

• Наблюдения за структурой хроматина с помощью электронного микроскопа показали, что как в препаратах выделенного интерфазного хроматина или выделенных митотических хромосом, так и в составе ядра на ультратонких срезах всегда видны элементарные хромосомные фибриллы толщиной 20—25 нм.

Фибриллы хроматина:

• В химическом отношении фибриллы хроматина представляют собой сложные комплексы дезоксирибонуклеопротеидов (ДНП), в состав которых входят ДНК и специальные хромосомные белки — гистоновые и негистоновые. В составе хроматина обнаруживается также РНК.

• Количественные отношения ДНК, белка и РНК составляют 1:1,3:0,2. Обнаружено, что длина индивидуальных линейных молекул ДНК может достигнуть сотен микрометров и даже сантиметров.

• Среди хромосом человека самая большая первая хромосома содержит ДНК с общей длиной до 7 см. Суммарная длина молекул ДНК во всех хромосомах одной клетки человека составляет около 170 см.

Нуклеосомы:

• Белки хроматина составляют 60—70% от его сухой массы. К ним относятся так называемые гистоны и негистоновые белки. Негистоновые белки составляют 20% от количества гистонов.

• Гистоны — щелочные белки, обогащенные основными аминокислотами (главным образом лизином и аргинином). Очевидна структурная роль гистонов, которые не только обеспечивают специфическую укладку хромосомной ДНК, но и имеют значение в регуляции транскрипции.

• Гистоны расположены по длине молекулы ДНК не равномерно, а в виде блоков. В один такой блок входят 8 молекул гистонов (по две молекулы H2A, H2B, H3, H4), образуя нуклеосому.

• Размер нуклеосомы около 10 нм. При образовании нуклеосом происходит компактизация, сверхспирализация ДНК, что приводит к укорачиванию длины хромосомной фибриллы примерно в 5 раз. Сама же хромосомная фибрилла имеет вид нитки бус или четок, где каждая бусина — нуклеосома

Слайд - Нуклеосома: а) схема нуклеосомы, ДНК делает 1,8 оборота (146 пар оснований), связанных снарухи гистонового ядра гистоном H1; б) нулеосомы диаметром 10 нм, между ними линкерная ДНК диаметром 2 нм.

Слайд - Нуклеосома: а) 4 пары гистонов, каждый связывает 27-28 пар оснований ДНК; b) то же, вид сбоку; с) схема связывания 73 пар оснований ДНК половиной набора гистонов нуклеосомы.

Модификация гистонов и «гистоновый код»: N-концевые аминокислотные остатки гистонов могут ацетилироваться, метилироваться или фосфорилироваться, что влияет на функции хроматина. Например, метилирование лизина 9 в гистоне H3 ведет к репрессии транскрипции

• Кариоти́п — совокупность признаков (число, размеры, форма и т. д.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного биологического вида (видовой кариотип), данного организма (индивидуальный кариотип) или линии (клона) клеток. Кариотипом иногда также называют и визуальное представление полного хромосомного набора (кариограммы).

Процедура определения кариотипа:

• Для процедуры определения кариотипа могут быть использованы любые популяции делящихся клеток.

• Для определения человеческого кариотипа используется либо одноядерные лейкоциты, извлечённые из пробы крови, деление которых провоцируется добавлением митогенов, либо культуры клеток, интенсивно делящихся в норме (фибробласты кожи, клетки костного мозга).

• Обогащение популяции клеточной культуры производится остановкой деления клеток на стадии метафазы митоза добавлением колхицина — алкалоида, блокирующего образование микротрубочек и «растягивание» хромосом к полюсам деления клетки и препятствующего тем самым завершению митоза.

• Полученные клетки в стадии метафазы фиксируются, окрашиваются и фотографируются под микроскопом; из набора получившихся фотографий формируются т. н. систематизированный кариотип — нумерованный набор пар гомологичных хромосом (аутосом), изображения хромосом при этом ориентируются вертикально короткими плечами вверх, их нумерация производится в порядке убывания размеров, пара половых хромосом помещается в конец набора.

Слайд - Исследование митотических хромосом и кариотип: кровь→культивирование лейкоцитов→через 3-е суток введение колхицина→через 3 часа фиксация клеток и мазок.

Слайд - Митотические хромосомы и кариотип человека: b) окраска мазка на ДНК флюоресцентными красками; с) кариотип (собраны гомологичные хромосомы).

Получение классического кариотипа:

• Для получения классического кариотипа используется окраска хромосом различными красителями или их смесями: в силу различий в связывании красителя с различными участками хромосом окрашивание происходит неравномерно и образуется характерная полосчатая структура (комплекс поперечных меток, англ. banding), отражающая линейную неоднородность хромосомы и специфичная для гомологичных пар хромосом и их участков (за исключением полиморфных районов, локализуются различные аллельные варианты генов).

Типы окрашивания хромосом:

• Q-окрашивание — окрашивание по Касперссону акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаицизма с участием Y-хромосом)

• G-окрашивание — модифицированное окрашивание по Романовскому — Гимзе. Чувствительность выше, чем у Q-окрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы)

• R-окрашивание — используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

• C-окрашивание — применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин и вариабельной дистальной части Y-хромосомы.

• T-окрашивание — применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Современное выявление хромосом:

• В последнее время используется методика т. н. спектрального кариотипирования (флюоресцентная гибридизация in situ, англ. Fluorescence in situ hybridization, FISH), состоящая в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом.

• В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характеристики, что не только существенно облегчает выявление таких пар, но и облегчает обнаружение межхромосомных транслокаций, то есть перемещений участков между хромосомами — транслоцированные участки имеют спектр, отличающийся от спектра остальной хромосомы.

Анализ кариотипов:

• Сравнение комплексов поперечных меток в классической кариотипии или участков со специфичными спектральными характеристиками позволяет идентифицировать как гомологичные хромосомы, так и отдельные их участки, что позволяет детально определять хромосомные аберрации — внутри- и межхромосомные перестройки, сопровождающиеся нарушением порядка фрагментов хромосом (делеции, дупликации, инверсии, транслокации).

• Такой анализ имеет большое значение в медицинской практике, позволяя диагностировать ряд хромосомных заболеваний, вызванных как грубыми нарушениями кариотипов (нарушение числа хромосом), так и нарушением хромосомной структуры или множественностью клеточных кариотипов в организме (мозаицизмом).

Лекция 13. Ядро клетки и контроль экспрессии генов

План

• Ядро эукариотической клетки

• Хромосомы и хроматин

• Гистоны

Внутренняя среда клетки – цитоплазма:

• Цитоплазма — сложно организованная система, включающая ядро, мембранные и немембранные органеллы, включения, которые находятся во взвешенном состоянии в гиалоплазме. Последняя представляет собой гель с изменяющейся в зависимости от функционального состояния клетки степенью вязкости.

• В составе гиалоплазмы находятся структурные и ферментные белки клетки, различные метаболиты, ионы. Здесь присутствуют ферменты, участвующие в синтезе аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот, биосинтезе сахаров. В гиалоплазме происходят процессы гликолиза и синтез части АТФ, модификация ферментов (например, фосфорилирование), приводящая к их активации, либо инактивации. В гиалоплазме начинается ряд биосинтетических процессов, которые в дальнейшем продолжаются в той или иной внутриклеточной системе.

• В электронном микроскопе гиалоплазма выглядит гомогенной и характеризуется низкой электронной плотностью. Мегавольтная электронная микроскопия обнаруживает в ней сеть, состоящую из тончайших фибрилл, пересекающих гиалоплазму в различных направлениях. В ячейках этой сети располагаются органеллы, а в ее "узлах" фиксированы полисомы. Микротрабекулярная сеть гиалоплазмы образует связи с микротрубочками и микрофиламентами опорно-двигательной системы клетки и совместно с этими элементами участвует в перемещении и функционировании внутриклеточных структур.

Ядро:

• С деятельностью ядра связаны хранение генетической информации, размножение клеток и передача генетического материала поколениям, участие в синтезе белков.

• В неделящихся клетках (интерфазе клеточного цикла) ядро хранит закодированную в ДНК хромосом информацию о белковом синтезе и обеспечивает синтез тех белковых молекул, которые необходимы клетке в процессе ее роста, дифференцировки и физиологической регенерации; в этот период в ядре синтезируются участвующие в образовании белка рибосомальная, информационная и трансферная РНК, формируются субъединицы рибосом.

• В интерфазе в составе ядра обнаруживаются оболочка (нуклеолемма), хроматин, нуклеоплазма, ядрышко.

• При подготовке клетки к делению ядро удваивает генетическую информацию о белковом синтезе, создавая ее точную копию для передачи дочерним клеткам.

Нуклеолемма – оболочка ядра:

• Ядерная оболочка представляет собой часть внутриклеточной мембранной системы (совместно с гранулярной и агранулярной эндоплазматической сетью). Она состоит из внутреннего и наружного листков, между которыми находится щелевидное пространство — перинуклеарное, ширина которого варьирует в зависимости от функциональной активности клетки.

• Наружный листок нуклеолеммы со стороны гиалоплазмы окружен сетью виментиновых промежуточных филаментов и имеет на своей поверхности свободные рибосомы, прикрепленные к ней большими субъединицами.

• Внутренний листок — гладкий, не содержит рибосом, образует связи с пластинкой (ламиной) ядра и участвует в фиксации интерфазных хромосом.

• Листки нуклеолеммы выполняют по отношению к ядру две важные функции — формообразовательную и рецепторно-барьерно-транспортную.

Перинуклеарное пространство:

• Перинуклеарное пространство прерывается множеством пор. Они представляют собой сквозные туннели, сообщающие содержимое ядра и гиалоплазмы. Стенка пор образована слившимися листками нуклеолеммы. В области пор отсутствует гетерохроматин.

• Диаметр ядерных пор — около 90 нм, а численность варьирует в зависимости от активности биосинтетических процессов в клетке.

• Поровые туннели заполнены поровыми комплексами, состоящими из трех компонентов: поровых колец, центральных спиц и центральной гранулы.

• Все компоненты порового комплекса — белковые производные, обеспечивающие строго избирательный транспорт макромолекул в ядро и из ядра.

Ядерная пластинка – ламина:

• Внутренняя ядерная мембрана связана с тонким волокнистым белковым слоем — ядерной ламиной, состоящей из белков ламинов, относящихся к полипептидам, образующим промежуточные 10-нм филаменты цитоплазмы.

• Густая сеть фибрилл ядерной ламины способна обеспечить целостность ядра, даже после растворения фосфолипидных мембран оболочки ядра в эксперименте. С внутренней стороны к ламине крепятся петли хроматина, заполняющего ядро.

Транспорт цитоплазма↔ядро:

• В процессе ядерно-цитоплазматического транспорта ядерная оболочка функционирует как некое молекулярное сито, пропуская ионы и мелкие молекулы (сахара, нуклеотиды, АТФ и др.) пассивно, по градиенту концентрации, и осуществляя активный избирательный транспорт крупных молекул белков и рибонуклеопротеидов, то есть комплексов рибонуклеиновых кислот (РНК) с белками. Для этого существует комплекс ядерной поры.

• Так, например, белки, транспортируемые в ядро из цитоплазмы, где они синтезируются, должны иметь определенные последовательности примерно из 50 аминокислот, (NLS последовательности), «узнаваемые» комплексом ядерной поры. В этом случае комплекс ядерной поры, затрачивая энергию в виде АТФ, активно транслоцирует белок из цитоплазмы в ядро.

• Клетка HeLa имеет 10 млн рибосом, для ее роста необходимо импортировать в ядро 560000 рибосомальных белков и экспортировать 14000 рибосомальных субъединиц за каждую минуту.

Ядерные поры:

• Ядерная оболочка имеет отверстия диаметром около 90 нм, образующиеся за счет слияния внешней и внутренней ядерных мембран. Такие отверстия в оболочке ядра окружены сложными белковыми структурами, получившими название комплекса ядерной поры.

• Восемь белковых субъединиц, входящих в состав ядерной поры, располагаются вокруг перфорации ядерной оболочки в виде колец, диаметром около120 нм, наблюдаемых в электронный микроскоп с обеих сторон ядерной оболочки.

• Белковые субъединицы комплекса поры имеют выросты, направленные к центру поры, где иногда видна «центральная гранула» диаметром 10-40 нм.

• Размер ядерных пор и их структура стандартны для всех клеток эукариот. Число ядерных пор зависит от метаболической активности клеток: чем выше уровень синтетических процессов в клетке, тем больше пор на единицу площади поверхности клеточного ядра.

Импорт белков из цитоплазмы в ядро: 1) NLS+рецептор импортин α/b связывается с цитоплазматическим филаментом; 2-3) перенос в ядро; 4) при взаимодействии с Ran-ГТФ комплекс диссоциирует, переносимый белок остается в ядре, а Ran-ГДФ+импортин-b и импортин-α возвращаются в цитозоль

Экспорт мРНК из ядра: 1)пре-мРНК содержит 3 экзона и 2 интрона; 2) сплайсинг с участием белков EJC и Aly; 3) связь с белком TAP обеспечивает перенос через пору; 4) в цитоплазме вспомогательные белки отщепляются и мРНК готова к трансляции

Эухроматин и гетерохроматин:

• Хроматин интерфазных ядер представляет собой хромосомы, которые, однако, теряют в это время свою компактную форму, разрыхляются, деконденсируются. Степень такой деконденсации хромосом может быть различной.

• Зоны полной деконденсации их участков морфологи называют эухроматином. При неполном разрыхлении хромосом в интерфазном ядре видны участки конденсированного хроматина, иногда называемого гетерохроматином.

• Степень деконденсации хромосомного материала — хроматина в интерфазе может отражать функциональную нагрузку этой структуры. Чем «диффузнее» распределен хроматин в интерфазном ядре (т.е. чем больше эухроматина), тем интенсивнее в нем синтетические процессы.

Хроматин – функции:

• Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде плотных хромосом. В этот период хромосомы не выполняют никаких синтетических функций, в них не происходит включения предшественников ДНК и РНК.

• Таким образом, хромосомы клеток могут находиться в двух структурно-функциональных состояниях: в активном, рабочем, частично или полностью деконденсированном, когда с их участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и редупликации, и в неактивном, в состоянии метаболического покоя при максимальной их конденсированности, когда они выполняют функцию распределения и переноса генетического материала в дочерние клетки.

• Наблюдения за структурой хроматина с помощью электронного микроскопа показали, что как в препаратах выделенного интерфазного хроматина или выделенных митотических хромосом, так и в составе ядра на ультратонких срезах всегда видны элементарные хромосомные фибриллы толщиной 20—25 нм.

Фибриллы хроматина:

• В химическом отношении фибриллы хроматина представляют собой сложные комплексы дезоксирибонуклеопротеидов (ДНП), в состав которых входят ДНК и специальные хромосомные белки — гистоновые и негистоновые. В составе хроматина обнаруживается также РНК.

• Количественные отношения ДНК, белка и РНК составляют 1:1,3:0,2. Обнаружено, что длина индивидуальных линейных молекул ДНК может достигнуть сотен микрометров и даже сантиметров.

• Среди хромосом человека самая большая первая хромосома содержит ДНК с общей длиной до 7 см. Суммарная длина молекул ДНК во всех хромосомах одной клетки человека составляет около 170 см.

Нуклеосомы:

• Белки хроматина составляют 60—70% от его сухой массы. К ним относятся так называемые гистоны и негистоновые белки. Негистоновые белки составляют 20% от количества гистонов.

• Гистоны — щелочные белки, обогащенные основными аминокислотами (главным образом лизином и аргинином). Очевидна структурная роль гистонов, которые не только обеспечивают специфическую укладку хромосомной ДНК, но и имеют значение в регуляции транскрипции.

• Гистоны расположены по длине молекулы ДНК не равномерно, а в виде блоков. В один такой блок входят 8 молекул гистонов (по две молекулы H2A, H2B, H3, H4), образуя нуклеосому.

• Размер нуклеосомы около 10 нм. При образовании нуклеосом происходит компактизация, сверхспирализация ДНК, что приводит к укорачиванию длины хромосомной фибриллы примерно в 5 раз. Сама же хромосомная фибрилла имеет вид нитки бус или четок, где каждая бусина — нуклеосома

Слайд: Нуклеосома: а) схема нуклеосомы, ДНК делает 1,8 оборота (146 пар оснований), связанных снаружи гистонового ядра гистоном H1; б) нулеосомы диаметром 10 нм, между ними линкерная ДНК диаметром 2 нм

Второй уровень компактизации: образование 30 нм - фибриллы

Высший уровень организации хроматина – хроматиновые петли: а) митотическая хромосома, из которой удалены гистоны сульфатом декстрана; б) петли хроматина в хромосоме

Итак, уровни организации хромосомы: ДНК→нуклеосома→филамент-10 нм →фибрилла-30 нм →петлевые домены →метафазная хромосома

Слайд: Модификация гистонов и «гистоновый код»: N-концевые аминокислотные остатки гистонов могут ацетилироваться, метилироваться или фосфорилироваться, что влияет на функции хроматина. Например, метилирование лизина 9 в гистоне H3 ведет к репрессии транскрипции

Кариотип:

• Кариоти́п — совокупность признаков (число, размеры, форма и т. д.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного биологического вида (видовой кариотип), данного организма (индивидуальный кариотип) или линии (клона) клеток. Кариотипом иногда также называют и визуальное представление полного хромосомного набора (кариограммы).

Процедура определения кариотипа:

• Для процедуры определения кариотипа могут быть использованы любые популяции делящихся клеток.

• Для определения человеческого кариотипа используется либо одноядерные лейкоциты, извлечённые из пробы крови, деление которых провоцируется добавлением митогенов, либо культуры клеток, интенсивно делящихся в норме (фибробласты кожи, клетки костного мозга).

• Обогащение популяции клеточной культуры производится остановкой деления клеток на стадии метафазы митоза добавлением колхицина — алкалоида, блокирующего образование микротрубочек и «растягивание» хромосом к полюсам деления клетки и препятствующего тем самым завершению митоза.

• Полученные клетки в стадии метафазы фиксируются, окрашиваются и фотографируются под микроскопом; из набора получившихся фотографий формируются т. н. систематизированный кариотип — нумерованный набор пар гомологичных хромосом (аутосом), изображения хромосом при этом ориентируются вертикально короткими плечами вверх, их нумерация производится в порядке убывания размеров, пара половых хромосом помещается в конец набора.

Слайд: Исследование митотических хромосом и кариотип: кровь→культивирование лейкоцитов→через 3-е суток введение колхицина→через 3 часа фиксация клеток и мазок

Получение классического кариотипа:

• Для получения классического кариотипа используется окраска хромосом различными красителями или их смесями: в силу различий в связывании красителя с различными участками хромосом окрашивание происходит неравномерно и образуется характерная полосчатая структура (комплекс поперечных меток, англ. banding), отражающая линейную неоднородность хромосомы и специфичная для гомологичных пар хромосом и их участков (за исключением полиморфных районов, локализуются различные аллельные варианты генов).

Типы окрашивания хромосом:

• Q-окрашивание — окрашивание по Касперссону акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаицизма с участием Y-хромосом)

• G-окрашивание — модифицированное окрашивание по Романовскому — Гимзе. Чувствительность выше, чем у Q-окрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы)

• R-окрашивание — используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

• C-окрашивание — применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин и вариабельной дистальной части Y-хромосомы.

• T-окрашивание — применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Современное выявление хромосом:

• В последнее время используется методика т. н. спектрального кариотипирования (флюоресцентная гибридизация in situ, англ. Fluorescence in situ hybridization, FISH), состоящая в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом.

• В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характеристики, что не только существенно облегчает выявление таких пар, но и облегчает обнаружение межхромосомных транслокаций, то есть перемещений участков между хромосомами — транслоцированные участки имеют спектр, отличающийся от спектра остальной хромосомы.

Анализ кариотипов:

• Сравнение комплексов поперечных меток в классической кариотипии или участков со специфичными спектральными характеристиками позволяет идентифицировать как гомологичные хромосомы, так и отдельные их участки, что позволяет детально определять хромосомные аберрации — внутри- и межхромосомные перестройки, сопровождающиеся нарушением порядка фрагментов хромосом (делеции, дупликации, инверсии, транслокации).

• Такой анализ имеет большое значение в медицинской практике, позволяя диагностировать ряд хромосомных заболеваний, вызванных как грубыми нарушениями кариотипов (нарушение числа хромосом), так и нарушением хромосомной структуры или множественностью клеточных кариотипов в организме (мозаицизмом).

Хромосомные аберрации:

• Хромосомные аберрации (хромосомные мутации, хромосомные перестройки) — изменения структуры хромосом.

• Классифицируют делеции (удаление участка хромосомы), инверсии (изменение порядка генов участка хромосомы на обратный), дупликации (повторение участка хромосомы), транслокации (перенос участка хромосомы на другую).

• Хромосомные перестройки носят, как правило, патологический характер и нередко приводят к гибели организма. Показано значение хромосомных перестроек в видообразовании и эволюции.