Введение в молекулярную биологию. Введение в изучение клеточной и молекулярной биологии 3 страница

Слайд: слева – зависимость ренативации от сложности генома (чем проще геном, тем быстрее ренативация). Справа – идеализованный график наличия фракций ДНК в зависимости от повторов. Высокоповторяемые последовательности ДНК делят на сателитные ДНК (сотни пар оснований), минисателитные ДНК (12-100 пар оснований, до 3000 повторов) и микросателитные ДНК (1-5 пар оснований, до 100000 повторов).

Сателлитная ДНК:

- У эукариот в состав ДНК входят фракции, которые ренатурируют с гораздо более высокой скоростью, чем можно было бы предполагать на основании размера их генома, а также фракция ДНК, ренатурирующая медленно, подобно уникальным последовательностям ДНК прокариот. Однако для эукариот требуется значительно большее время для ренатурации этой фракции, что связано с общим большим размером их генома и с большим числом различных уникальных генов.

- Фракции с часто повторяющимися последовательностями могут обладать иной плавучей плотностью, чем основная масса ДНК, и поэтому могут быть выделены в чистом виде, как так называемые фракции сателлитной ДНК. У мыши эта фракция имеет плотность, равную 1,691 г/мл, а основная часть ДНК - 1,700 г/мл. Эти различия плотности определяются различиями в нуклеотидном составе. Например, у мыши в этой фракции имеется 35% Г и Ц пар, а в основном пике ДНК - 42%.

• Как оказалось, сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, не участвует в синтезе основных типов РНК в клетке, не связана с процессом синтеза белка. Этот вывод сделан был на основании того, что ни один из типов РНК клетки (тРНК, иРНК, рРНК) не гибридизируется с сателлитными ДНК. Следовательно, на этих ДНК нет последовательностей, отвечающих за синтез клеточных РНК, т.е. сателлитные ДНК не являются матрицами для синтеза РНК, не участвуют в транскрипции.

• Существует гипотеза о том, что высокоповторяющиеся последовательности, не участвующие непосредственно в синтезе белков, могут нести информацию, играющую важную структурную роль в сохранении и функционировании хромосом. К ним могут быть отнесены многочисленные участки ДНК, связанные с белками остова интерфазного ядра, участки начала репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.

Геном человека – повторяющиеся ДНК:

• В ходе проекта выяснилось, что «смысловые» участки ДНК, содержащие гены, кодирующие информацию о белках, занимают лишь 1% генома. Около 99% последовательностей ДНК генома человека относят к некодирующей ДНК (называемой также «мусорной» (junk DNA), которая не экспрессируется, то есть не имеет выражения в белке. В основном это многократно повторяющиеся некодирующие последовательности нуклеотидов.

• Различают несколько классов повторяющейся ДНК. Основные два класса - тандемные (состоящие из очень простых, относительно небольших последовательностей, уложенных тандемно – «голова к хвосту») и диспергированные (обнаруживающиеся повсеместно, рассеянные по геному) повторы.

• Диспергированные повторы занимают не менее 46% генома человека. К ним относят ДНК-транспозоны, которые интересны тем, что они «путешествуют» по геному, «вырезаясь» из одной области ДНК и «вставляясь» в другую (механизм «вырезать-вставить»). Также в геноме присутствуют так называемые ретропозоны – это повторяющиеся участки, способные не просто перемещаться по геному, но и размножаться (с помощью процесса обратной транскрипции, т.е. синтеза ДНК на РНК-матрице, эти повторяющиеся последовательности расселяются по геному по механизму «копировать-вставить»). Все эти повторяющиеся последовательности некодирующей ДНК большинством исследователей считаются остатками древних вирусов, в незапамятные времена встроивших свой генетический материал в геномы живых организмов, в том числе и человека.

Мусорная ДНК:

Более трети человеческого генома занимают два класса «мусорной» ДНК – длинные и короткие рассеянные (диспергированные) повторы. Длинные диспергированные повторы (у человека самый распространенный из них - повтор LINE1, занимающий 17% длины генома) интересны тем, что при их анализе были найдены две открытые рамки считывания. Экспериментально выделили соответствующие белки. Оказалось, что оба белка обладают свойствами, необходимыми для ретропозиции (копирования и расселения повтора по геному). С длинного повтора с помощью этих белков считывается РНК, которая затем обратно транскрибируется. ДНК-копия повтора встраивается в геном в новом месте. Таким образом, «мусорную» ДНК нельзя назвать в полном смысле слова «некодирующей» - в действительности она кодирует ферменты, необходимые для ее собственного размножения в геноме. Другие функции этих ферментов пока не ясны.

Роль мусорной ДНК:

• По поводу «мусорной» ДНК существуют самые разные предположения, зачастую противоречащие друг другу. Много лет назад Френсис Крик, один из двух первооткрывателей двойной спирали ДНК, назвал ее издержкой эволюции, платой за совершенство остальной части генома. Возможно, небольшая доля ДНК человека и других высших организмов действительно относится к такому типу, однако теперь ясно, что основная доля «мусорной» ДНК сохраняется в эволюции и даже увеличивается в размерах, в действительности давая ее обладателям некие эволюционные преимущества. Как выяснилось в последние годы, структура повторов консервативна, то есть мутации, нарушающие «правила», установленные природой для этих элементов, отбрасываются в ходе естественного отбора или компенсируются другими мутациями.

• Структурное постоянство – мощный аргумент в пользу идеи того, что это отнюдь не «мусорная», а очень важная для жизни вида ДНК. Другое дело, что мы еще не знаем, в чем конкретно состоит ее биологическая роль.

Разбавление генома:

• Если сравнить данные, полученные при анализе генома дрожжей и анализе генома человека, то становится очевидным, что доля кодирующих участков в расчете на весь геном в ходе эволюции резко уменьшается – у дрожжей она очень высока, у человека – очень мала. Это известно сравнительно давно, но сейчас эти соотношения приобрели количественную меру и структурное обоснование.

• Мы приходим к достаточно парадоксальному на первый взгляд выводу: эволюция эукариот от низших форм к высшим сопряжена с «разбавлением» генома – на единицу длины ДНК приходится все меньше информации о структуре белков и РНК, и все больше информации «ни о чем». Это одна из больших загадок биологической эволюции, обнаруженная благодаря проекту «Геном человека».

Лекция 9. Экспрессия генетического материала: от транскрипции до трансляции

План

• Основной постулат молекулярной биологии.

• Особенности транскрипции у прокариот и эукариот.

• Синтез и процессинг рРНК, тРНК и иРНК.

• Малые некодирующие РНК и интерферирующие РНК (siRNA).

• Генетический код.

• Особенности митохондриального генетического кода.

• Адаптерная роль аминоацил-тРНК.

• Молекулярные основы трансляции.

Матричные синтезы:

• Существует 3 вида передачи наследственной информации (матричных синтезов): 1) ДНК ® ДНК – репликация; 2) ДНК ® РНК – транскрипция и 3) РНК ® белок – трансляция.

• ДНК является макромолекулой, которая переносит генетическую информацию от поколения к поколению. Одна клетка млекопитающих содержит только несколько пикограммов (10^-12 г) ДНК.

По программе генов синтезируются белки-ферменты:

• В 40-х годах ХХ века Georg Beadl и Edward Tatum проверили эту идею. Они исследовали плесень Neurospora, для роста которой требовалась простая среда (глюкоза, неорганические соли и биотин). Предположили, что 1) все остальное этот организм синтезирует сам и поэтому 2) такой организм крайне чувствителен к дефициту ферментов.

• 1) Ученые облучили споры плесени, выращенные на минимальной среде; 2) после облучения споры плесени росли только на обогащенной среде; 3) полученные споры оценивались на рост в минимальной и обогащенной средах; 4) споры высаживали на 2 минимальные среды, одна с добавлением витаминов, другая – аминокислот; обнаружен рост в среде с витаминами; 5) высевали споры на минимальные среды с добавлением одного витамина и рост обнаружили только в среде с пантотеновой кислотой.

Выводы из эксперимента Beadle-Tatum:

• Ученые облучали тысячи спор и получали несколько мутантных организмов, которые не могли расти на минимальной среде, а требовали для роста одного из витаминов. Следовательно, после облучения в некоторых спорах исчезала информация, необходимая для синтеза ферментов образования того или иного витамина.

• Была сформулирована гипотеза: один ген – один фермент.

• Затем эта гипотеза бьыла модифицирована – один ген – одна полипептидная цепь.

Транскрипция:

• Синтез РНК на матрице ДНК называется транскрипцией. Последовательность рибонуклеотидов в молекуле РНК комплементарна последовательности дезоксирибонуклеотидов одной из цепи ДНК. Та из двух цепей ДНК, по которой непосредственно идет транскрипция РНК-молекул, называется кодирующей цепью. Другую цепь называют некодирующей цепью соответствующего гена.

• Единицей транскрипции является оперон (у прокариот) и транскриптон (у эукариот). По функциональному признаку в опероне выделяют регуляторные и структурные области:

1) промотор - место инициации транскрипции, к которому присоединяется фермент РНК-полимераза; в ДНК E. coli имеется 2000 промоторов на 4,8×10⁶ пар оснований;

2) ген-оператор (или акцепторная зона у эукариот) - место связывания регуляторных белков, например, белка-репрессора;

3) структурные гены, включающие информативные участки - экзоны и неинформативные участки - интроны;

4) терминатор - последовательность нуклеотидов, сигнализирующая о завершении транскрипции.

Слайд: ядрышко: а) белки рибосом, меченные зеленым флуоресцирующим белком (GFP), синтезируются в цитозоле и переносятся в ядрышко, где включаются в рибосомы; b) строение ядрышка (fc – ДНК для рРНК, dfc – пре-рРНК, gc-рибосомальные субъединицы. Ядро, изолированное из яйцеклетки Xenopus, содержит сотни ядрышек.

Промоторы:

• У бактерий функцию промотора выполняют две последовательности нуклеотидов на 5′-конце молекулы. Одна из них называется блок Прибнова (ТАТААТ), центр которого располагается в положении -10 (10 нуклеотидов на 5′-конце от первого транскрибируемого нуклеотида, обозначаемого +1). Другая последовательность, называемая -35 область, имеет последовательность ТТГАЦА. Это идеализированные последовательности, более характерные для промоторов клеток-прокариот. Первым транскрибируемым нуклеотидом является пуриновый нуклеотид.

• Эукариотические гены, кодирующие белки, имеют блок Хогнесса (ТАТААА) в положении -25, а также ЦААТ-блок (ГГNЦААТЦТ) в положении -75. Транскрипция у эукариот регулируется энхансерными (усиливающими) последовательностями, которые могут отстоять на несколько kb от стартового нуклеотида.

Эффективность промоторов:

• Промоторы отличаются по эффективности.

• Гены со строгими промоторами в клетке E. coli транскрибируются каждые 2 секунды, а транскрибирование генов со слабыми промоторами происходит один раз за 10 минут.

• Мутации в областях -1 или -35 подавляют активность промотора. Расстояние между этими областями оптимально в 17 нуклеотидов.

• Эффективность промоторов регулируется особенностями их нуклеотидного состава, а также регуляторными белками, связывающимися с ДНК рядом с областью промоторов.

Условия для протекания транскрипции:

Матрица, которой является неспаренная цепь ДНК. В отличие от репликации транскрипция происходит на определенном фрагменте ДНК.

2. Субстраты. Для синтеза РНК необходимы четыре типа рибонуклеозид-5′-трифосфатов: АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ. Разрыв макроэргической связи между α и β-остатками фосфорной кислоты обеспечивает процесс синтеза энергией.

3. Транскрипция происходит с участием ферментов ДНК-зависимых РНК-полимераз (у эукариот I, II и III для синтеза рРНК, иРНК и тРНК, ответственно).

4. Длясинтеза РНК, комплементарной одной из цепи ДНК, спиральная молекула ДНК расплетается на коротком участке с формированием транскрипционного «пузыря». Во время транскрипции у E.coli расплетенный фрагмент составляет около 17 пар нуклеотидов.

РНК-полимераза прокариот:

• РНК-полимераза E.coli состоит из 5 субъединиц (a2bb′ω, м.м. 390 000) и шестой s-субъединицы. Фермент, состоящий из 6 субъединиц, называется холоферментом.

• Установлено, что b-субъединица участвует в связывании рибонуклеозидтрифосфатов, b′-субъединица – в связывании фермента с ДНК-матрицей, a-субъединица участвует в инициации транскрипции; функция ω-субъединицы не известна.

• Структура фермента без s-субъединицы называется кор-ферментом. Этот фактор находит строго определенные последовательности нуклеотидов в промоторе, способствует более прочному связыванию полимеразы со специфической промоторной последовательностью ДНК и участвует в раскрывании двойной спирали ДНК, так чтобы одна из цепей могла служить матрицей.

• s-Субъединица не участвует в стадии элонгации. Различные s-субъединицы узнают различные последовательности нуклеотидов в промоторе. Большинство s-субъединиц являются s70 (м.м. 70 000).

Синтез РНК включает 3 стадии: инициации, элонгации и терминации:

• На стадии инициации РНК-полимераза с помощью s-субъединицы через серию случайных актов ассоциации-диссоциации находит промотор и происходит присоединение всей молекулы РНК-полимеразы.

• После синтеза цепочки РНК примерно из 8 рибонуклеотидов s-субъединица отделяется от холофермента и присоединяется к другой молекуле РНК-полимеразы.

• Синтезируемые цепи РНК имеют на 5′-конце обычно остаток ГТФ или АТФ (рррА, либо рррГ).

• Следовательно, новообразованная цепь РНК имеет трифосфатную группу на 5′-конце и свободную ОН-группу на 3′-конце.

Элонгация:

• Максимальная скорость элонгации составляет примерно 50 нуклеотидов в секунду.

• В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза не проверяет правильности новообразованной полинуклеотидной цепи.

• В связи с этим надежность транскрипции значительно ниже, чем надежность репликации. Частота ошибок при синтезе РНК составляет примерно одну ошибку на 10⁴-10⁵ нуклеотидов, что в 10⁵ раз выше, чем при синтезе ДНК.

• Гораздо более низкую надежность синтеза РНК клетка обходит тем, что с одного гена синтезируется много копий РНК-транскриптов.

Терминация:

• Сигнал терминации синтеза молекулы РНК представляет собой определенную последовательность нуклеотидов, расположенную в рамках кодирующей цепи ДНК. Процесс терминации у эукариот не достаточно изучен. У E.coli существует два механизма терминации: 1) с участием специфического белка, называемого r-фактором и 2) r-независимый механизм.

Предшественники РНК:

• В результате транскрипции образуются три типа предшественников РНК (первичные транскрипты): предшественник мРНК, или гетерогенная ядерная РНК (пре-мРНК или гяРНК), предшественники рРНК (прерРНК), содержащие 5,8S РНК, 18S РНК и 28S РНК у эукариот и, соответственно 5S, 16S РНК и 23S РНК у прокариот, предшественники тРНК (пре-тРНК).

• Они представляют собой копию оперона и содержат информативные и неинформативные последовательности.

• Образование функционально активных молекул РНК называется процессингом и продолжается после завершения транскрипции.

Путь к трансляции:

• Генетическая информация, хранящаяся в ДНК, передается на РНК:

• ДНК- нематричная цепь (кодирующая, или смысловая) 5′-ГГАТГЦАТ-3′

• ДНК- матричная цепь (некодирующая,

• несмысловая) 3′-ЦЦТАЦГТА-5′

• Цепь мРНК 5′-ГГАУГЦАУ-3′

• У вирусов часто матричную цепь называют (-)-цепью, а нематричную (+)-цепью.

• Биосинтез полипептида или белка на матрице РНК называется трансляцией.

Синтез белка на матрице мРНК идет в пять стадий:

• Стадия активации аминокислот – образования аа-тРНК

• Стадия инициации

• Стадия элонгации

• Стадия терминации

• Стадия пострибосрмальной модификации полипептидной цепи

Стадия 1 - активация аминокислот:

• Этот процесс протекает в цитозоле, а не в рибосоме. Каждая из 20 аминокислот ковалентно присоединяется к определенной тРНК, используя для этого энергию АТФ. Значение стадии: 1) активация СООН-группы аминокислоты, которая может участвовать в образовании пептидной связи; 2) аминокислоты сами не могут узнавать кодоны мРНК, а переносятся к рибосомам тРНК, которые посредством специфических антикодонов узнают кодоны мРНК и выполняют, таким образом, роль адапторных молекул.

• Фермент аминоацил-тРНК-синтетаза обладает специфичностью к аминокислоте и к тРНК. Фермент имеет 4 центра связывания: 1) для тРНК; 2) для АТФ; 3) для аминокислоты; 4) для воды. Гидролитическая активность фермента необходима для удаления «неправильной» аминокислоты с последующим присоединением «правильной» аминокислоты к тРНК.

Стадия инициации синтеза белка:

• На стадии инициации требуется разместить рибосому на 5’-конце мРНК и связать с инициирующим кодоном антикодон формилметионин-тРНК.

• Пептидильный участок (Р-участок) имеет сродство к пептидам и содержит в процессе синтеза растущую полипептидную цепь.

• Аминоацильный участок (А-участок) содержит аминоацил-тРНК, соединенную с соответствующим кодоном мРНК.

• Е-участок является местом в 50S субъединице, откуда тРНК покидают рибосому во время элонгации.

Цикл элонгации включает 3 этапа: 1) связывание аминоацил-тРНК; 2) образование пептидной связи; 3) траслокацию:

• 1 этап –Тройной комплекс, аминоацил-тРНК–EF-Tu·ГДФ, взаимодействует антикодоном с кодоном мРНК в А-участке рибосомы по принципу комплементарности.

• 2 этап –Пептидная связь образуется между двумя аминокислотами, которые связаны с тРНК в А- и Р-участках рибосомы. В результате образуется дипептидил-тРНК в А-участке и деацилированная тРНК остается связанной с Р-участком. Образование пептидной связи катализируется ферментом пептидилтрансферазой (составная часть 50S субъединицы рибосомы)

• 3 этап - При участии фактора EF-G (транслоказа) и за счет энергии ГТФ происходит процесс транслокации – рибосома перемещается на один кодон мРНК в направлении 5′→3′, пептидил-тРНК перемещается в Р-участок, а тРНК из Р-участка перемещается в Е-участок, а затем высвобождается в цитозоль. В результате транслокации в А-участок рибосомы приходит следующий новый кодон мРНК. К нему методом случайного подбора присоединяется комплементарная аминоацил-тРНК.

Стадия терминации:

После многих циклов элонгации, в результате которых синтезируется полипептидная цепь белка, в А-участке появляется терминирующий или нонсенс-кодон (УАА, УАГ, УГА).

• 2. В норме отсутствуют молекулы тРНК, способные узнавать нонсенс-кодоны. Факторы терминации узнают данные кодоны: RF1 узнает кодоны УАА и УАГ, RF2 – УАА и УГА.

• 3. Связывание релизинг-фактора с терминирующим кодонам в А-участке активирует пептидилтрансферазу, которая гидролизует связь между полипептидом и тРНК в Р-участке.

• После гидролиза и высвобождения синтезированного полипептида и тРНК рибосома диссоциирует на малую и большую субъединицы, готовых к синтезу новой полипептидной цепи.

Посттрансляционная модификация полипептидной цепи:

• Многие полипептиды, образующиеся при трансляции мРНК подвергаются модификации различными способами:

• Модификация N-конца и С-конца

• Удаление сигнальных последовательностей

• Образование дисульфидных мостиков

• Модификация боковых цепей аминокислот

• Частичный протеолиз

Лекция №10. Репликация ДНК и репаративный синтез ДНК

План

- Полуконсервативный тип репликации

- Стадии инициации, элонгации, терминации

- Репаративный синтез ДНК

- Теломеры, теломераза

Полуконсервативный тип репликации:

• Репликация - процесс передачи генетической информации от ДНК к ДНК. Протекает в S-фазу клеточного цикла.

• Репликация происходит полуконсервативным способом. Полуконсервативный способ означает, что цепи материнской молекулы ДНК расходятся и каждая служит матрицей для синтеза новой комплементарной последовательности. Две образовавшиеся двуспиральные молекулы ДНК, каждая из которых состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной комплементарной цепи, распределяются между двумя дочерними клетками.

• Таким образом, каждая из дочерних клеток получают информацию, идентичную той, которой обладала родительская клетка.

Описание опыта Мезельсона и Сталя:

• Полуконсервативный механизм репликации у бактерий E.coli был однозначно продемонстрирован в классическом эксперименте М.Мезельсона и Ф.Сталя в 1957 г. с применением тяжелого изотопа азота в сочетании с градиентным ультрацентрифугированием.

• E.coli выращивали в течение ряда поколений на среде, содержащей в качестве единственного источника азота хлористый аммоний (NH₄Cl) с "тяжелым" изотопом 15N. Вследствие этого все азотсодержащие соединения, в том числе и основания ДНК, включали этот изотоп в свой состав.

• Затем E.coli переносили на среду, в которой находился NH₄Cl с изотопом ¹⁴N. После первого деления обе молекулы ДНК содержали одну "легкую" и одну "тяжелую" цепи. После второго удвоения образовались две молекулы "легкой" ДНК и две гибридные (одна "легкая" и одна "тяжелая" цепи). И т.д.

Что необходимо для репликации?

• 1. Матрица, которой является неспаренная цепь ДНК.

• 2. Субстраты синтеза, которыми являются дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, ТТФ).

• Синтез идет по схеме: d(НМФ)n + dНТФ=d(НМФ)n+1 + PPн, где d(НМФ)n – ДНК до удлинения, d(НМФ)n+1 – ДНК после удлинения, dНТФ – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, РРн – пирофосфат.

• Нуклеозидтрифосфаты необходимы в качестве источника энергии, т.к. при расщеплении пирофосфата выделяется энергия для образования фосфодиэфирных связей.

• Ферменты и белковые факторы, участвующие в синтезе ДНК:

1. ДНК-полимеразы I и III (у прокариот), которые участвуют в образовании 3',5'-фосфодиэфирных связей и обладают 3'®5' и 5'®3' экзонуклеазными активностями; ДНК-полимераза II, IV и V, участвуют в специфической репарации; у эукариот найдено пять типов ДНК-полимераз: α, ε, β, γ и δ.

2. DnaА-белок – узнает участок начала репликации.

3. DnaB-белок (хеликаза) – расплетает двойную спираль ДНК.

4. DnaС-белок – необходим для присоединения хеликазы к месту инициации синтеза.

5. ДНК-связывающий белок – стабилизирует расплетенные одноцепочечные участки ДНК и повышает активность хеликазы.

7. ДНК-гираза (топоизомераза II) вводит отрицательные супервитки в ДНК, выполняя функцию шарнира при продвижении репликационных вилок.

8. Праймаза (ДНК-зависимая РНК-полимераза, dnaG-белок) синтезирует РНК-затравку (праймер).

9. ДНК-лигаза - соединяет концы фрагментов ДНК.

Стадия инициации:

• Репликация ДНК у E.coli начинается в области начала репликации, который называется oriC

• Два гексамера dnaB-белка присоединяются к каждой цепи ДНК и действуют как хеликазы (helix - спираль), расплетая в обоих направлениях ДНК. На разделение каждой пары оснований расходуется энергия гидролиза двух молекул АТФ

• К каждой из разделившихся цепей прочно присоединяются несколько молекул ДНК-связывающего белка (SSB белок – single strand binding), которые препятствуют обратному восстановлению цепей

Синтез праймера:

• В каждой репликативной вилке выделяют 3' и 5' концы. Синтез дочерних нитей ДНК происходит всегда в направлении 5'®3'.

• Стадия инициации завершается синтезом праймера - короткого фрагмента РНК, состоящего из 10-60 рибонуклеотидов, комплементарных одной из цепи матричной ДНК. Синтез праймера осуществляется ферментом ДНК-зависимой-РНК-полимеразой или праймазой.

• Синтез праймера необходим для фермента ДНК-полимеразы III, который не может начать синтез дочерней нити ДНК на "пустом" месте; 3′-ОН группа концевого рибонуклеотида праймера служит затравкой для синтеза ДНК под действием ДНК-полимеразы.

ДНК-гираза:

• У прокариот хеликазе помогает фермент ДНК-гираза (семейство топоизомераз). Гираза выполняет функцию шарнира: он обеспечивает кратковременный разрыв одной из цепи ДНК, быстро восстанавливаемый с высокой точностью после одного или нескольких оборотов вокруг второй цепи.

• В результате расплетения молекулы ДНК образуется репликационный пузырь, который состоит из 2 репликативных вилок.

• Процесс репликации происходит в обеих репликативных вилках, но имеет противоположное направление, что обусловлено антипараллельностью двух полинкуклеотидных цепей ДНК.

Элонгация репликации:

• К 3’-ОН группе праймера присоединяется ДНК-полимераза III которая по принципу комплементарности синтезирует дочернюю цепь ДНК в направлении 5′®3′.

• Точность синтеза определяется тем, что феpмент ДНК-полимераза III катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание предыдущего нуклеотида комплементарно соответствующему основанию матрицы. Если не произошло образование водородных связей между присоединенным нуклеотидом и матрицей, фермент возвращается, вырезает неправильный нуклеотид с 3'-конца цепи за счет экзонуклеазной активности, после чего ДНК-полимеpаза продолжает присоединять правильные нуклеотиды в направлении 5'®3'.

• У E.coli частота ошибок составляет 1 на 10⁹-10¹⁰присоединенных нуклеотидов. Хромосомы E.coli содержат 4,6 × 10⁶ пар нуклеотидов. Следовательно, частота ошибок составляет 1 на 1 000 – 10 000 репликаций.

Лидирующая и запаздывающие цепи:

• Если направление синтеза дочерней цепи ДНК и направление движения репликативной вилки совпадают, то цепь синтезируется непрерывно и называется лидирующей.

• Если направление синтеза ДНК и движение репликативной вилки не совпадают – цепь синтезируется фрагментами и называется запаздывающей. Фрагменты, синтезиpованные в запаздывающей цепи, называются фрагментами Рейджи Оказаки и состоят из 1000-2000 нуклеотидов у пpокаpиот и 100-200 нуклеотидов у эукариот.

• Возможно, что после синтеза праймера дальнейшее образование ДНК на обеих дочерних цепях осуществляет один и тот же фермент – ДНК-полимераза III, благодаря образованию петли на запаздывающей цепи.

Координация синтеза лидирующей и запаздывающей цепей ДНК: образование петли запаздывающей цепью позволяет димерному холоферменту ДНК-полимеразы III одновременно и в одном направлении синтезировать обе дочерних цепи ДНК (на запаздывающей цепи после синтеза праймера) (по А. Корнбергу). Две ДНК-полимеразы для лидирующей и запаздывающей цепей работают совместно как часть единого комплекса.

Замена праймера на цепь ДНК и сшивание фрагментов Оказаки:

• После завеpшения синтеза фpагмента Оказаки РНК-затpавка (пpаймеp) удаляется нуклеотид за нуклеотидом с помощью 5'®3' экзонуклеазной активности ДНК-полимеpазы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеpазной pеакции, осуществляемой ДНК-полимеpазой I (пpи этом в качестве затpавки используется 3'-конец пpедыдущего фpагмента Оказаки).

• Новый фрагмент Оказаки присоединяется к запаздывающей цепи ДНК с помощью феpмента ДНК-лигазы. Источником энергии для этой pеакции у эукаpиот служит АТФ. ДНК-лигаза не может соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК.

Дата добавления: 2016-04-11; просмотров: 1316;