Метод хемолюминесценции в исследовании генерации активных форм кислорода и перекисного окисления липидов

Основным методом обнаружения свободно радикальных состояний (в частности, АФК) является метод хемилюминесценции. ХЛ – это свечение, возникающее в ходе химической реакции. Хемилюминесценцией (ХЛ) называется люминесценция, возбуждаемая в результате химической реакции. ХЛ имеет две стадии: химическую, в которой происходит электронное возбуждение продукта в единичном акте химической реакции и физическую, в которой возбужденный продукт испускает квант света при переходе из синглетного или триплетного состояния в основное.

Вероятность образования в результате химической реакции возбужденного продукта

называется квантовым выходом возбуждения (Кв). Он равен отношению количества

возбужденных молекул продукта к общему количеству молекул продукта, полученных в

результате реакции. Вероятность испускания света возбужденными молекулами продукта

называется квантовым выходом люминесценции (Кл) и является отношением количества

квантов света, испущенных молекулами продукта, к количеству возбужденных молекул

продукта. Величины квантовых выходов возбуждения и люминесценции всегда меньше

единицы.

Интенсивность излучения света в ХЛ реакции (Iхл) пропорциональна скорости химической

реакции (w) и величинам квантовых выходов возбуждения и люминесценции:

Iхл= w* Кв* Кл

На интенсивность ХЛ могут влиять тушители (Т), которые перехватывают энергию

возбужденного продукта и переводят ее в тепловую форму. Интенсивность ХЛ в этом случае

описывается уравнением Штерна-Фольмера

IT = Io/(1+k* τ* [T])

где Io - интенсивность ХЛ в отсутствии тушителя, IT - интенсивность ХЛ в присутствии

тушителя, τ -время жизни возбужденногj состояния продукта ХЛ реакции [T] -концентрация тушителя, k- константа взаимодействия

Добавление в ХЛ систему соединений, обладающих высоким квантовым выходом

люминесценции - активаторов, может привести к усилению излучения в связи с тем, что

энергия возбуждения продукта будет передаваться на молекулу активатора.

Синглетно возбужденный кислород способен к собственной люминесценции при переходе в свое основное состояние (для кислорода основным состоянием является триплетное). Однако протекание такого типа реакций в биологических системах маловероятно по ряду причин. Во-первых, время жизни синглетного кислорода (без учета взаимодействия с органическими молекулами) в водных системах порядка 2 микросекунд. Во-вторых, синглетно возбужденный кислород с очень высокой скоростью вступает в реакции с различными ненасыщенными соединениями. В биологических системах защиту от синглетного кислорода осуществляют главным образом каротиноиды и α-токоферол

(витамин Е)- чрезвычайно эффективные тушители сиглетного кислорода.

Метод ХЛ играет большую роль в исследовании перекисного окисления липидов. Так как эти реакции также относятся к свободнорадикальным. Они являются естественными при нормальном функционировании биомембран. Процесс окисления начинается с образованием свободнорадикальных продуктов за счёт разрыва в молекуле угледоводорода С-С или С-Н связей. Сначала алкильный радикал реагирует с кислородом с образованием перекисного радикала, затем после его взаимодействия с субстратом появляется перекись: R'+ O₂ àROO’+RH àROOH+R’

Хемилюминесцентный метод позволяет непрерывно получать информацию о скорости

протекания свободнорадикального окисления в нативном организме. Исследование кинетики ХЛ позволяет судить о физиологическом состоянии организма при воздействии различных факторов среды. В частности, спонтанное свечение корней растений при действии неблагоприятных факторов может показать устойчивость растения к данному воздействию и оценить обратимость его действия.