Метод локальной фиксации напряжения (пэтч-кламп).

Ионные каналы биоло­гических мембран исследуют главным образом с помощью метода локальной фик­сации напряжения (пэтч-кламп-метод).

В этом методе на­пряжение фиксируют на микроучастке клеточной поверхности, что позволяет ре­гистрировать токи одиночных ионных каналов.

В качестве измерительного элек­трода используют стеклянную микропипетку с диаметром отверстия 0,5-1 мкм и электрическим сопротивлением около 5 МОм. С помощью специального устрой­ства в пипетке можно создать пониженное давление и втянуть фрагмент клеточ­ной мембраны в кончик микроприсоски. Клеточная мембрана образует плотный и механически прочный контакт о торцом микропипетки => обеспе­чивается надежная электрическая изоляция мембранного фрагмента от остальной поверхности клетки и внеклеточного раствора. Сопротивление изоляции достига­ет 100 ГОм (гигаомный контакт), что обусловливает низкие значения тока утеч­ки и низкий уровень шумов тока => могут быть зарегистрирова­ны изменения тока, связанные с открыванием и закрыванием отдельных ионных каналов.

Благодаря механической прочности контакта между стеклом в торце микро­пипетки и клеточной мембраной мембранный фрагмент можно отделить от клет­ки, получив доступ к его внутренний поверхности, либо разрушить мембранную перегородку в кончике пипетки и получить сравнительно низкоомный контакт с внутриклеточной средой. В зависимости от условий различают несколько вари­антов измерений:

1) на микроучастке мембраны с прикрепленной клеткой (обеспечиваются условия, наиболее близкие к физиологическим для работы ионных каналов, при этом сохраняются механизмы внутриклеточной регуляции канальной активности и связи канала с перифериче­скими слоями цитоплазмы)

2) на изолированном участке мембраны с внешней поверхностью, обращенной внутрь пи­петки,

3) на изолированном фрагменте, внешняя поверхность которого обращена наружу (2,3 -возможность полного контроля ионного состава растворов с обеих сторон мембра­ны),

4) измерение интегральных токов на целой клетке (метод внутренного диализа) (позволяет измерять ионные токи через всю клеточную поверхность на клетках малого размера (диаметр 10—20 мкм) в условиях постепенного вымывания компонентов цитоплазмы и их замещения на раствор, заполняющий микроприсоску).

Измерения токов одиночных каналов при различных напряжениях и разном ионном составе окружающих растворов дают сведения о проводимости каналов, среднем времени открытого и закрытого состояний, несут информацию о потенциалозависимости и селективности каналов, и дают основу для построения кинетиче­ских моделей функционирования ионных каналов. Этот метод позволяет также ис­следовать модификации структурно-функциональных характеристик каналов при воздействии различных фармакологических препаратов.