МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.

Препарат может представлять мазок (крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (соединительной рыхлой, брюшины, плевры), тонкий срез (наиболее часто используемый).

Процесс приготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие этапы:

1. взятие материала и фиксация его;

2. уплотнение материала;

3. приготовление срезов;

4. окрашивание;

5. заключение в бальзам (для световой микроскопии).

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путем химического их сшивания. Маленький образец органа погружают в фиксатор (спирт, формалин, осьмиевая кислота и др.) или замораживается.

Фиксация приводит к уплотнению кусочков. Уплотнение их продолжают удалением воды – обезвоживанием в спиртах возрастающей концентрации от 60º до 100º, пропитыванием парафином или целлоидином, или заливают в пластические среды и смолы (глутаральдегид).

Приготовление срезов производится при помощи микротома (для световой микроскопии) и ультрамикротома (для электронной микроскопии) – специальных приборов.

Стальной нож микротома позволяет получить срезы толщиной 3-8 мкм из залитых в парафин, целлоидин или полиэтиленгликоль кусочков ткани.

Стекляные или алмазные ножи позволяют получать срезы толщиной 1-5 мкм (для электронной микроскопии).

Срезы для световой микроскопии помещают на предметное стекло.

Окрашивание срезов (в световой) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) производят для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе.

Перед окрашиванием срезы депарфинируют и доводят до воды в спиртах нисходящей концентрации. Методы окраски гистологических препаратов очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования. Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные.

Кислые красители (например, эозин, конгокрасный) связываются со структурами, имеющими щелочную реакцию (цитоплазматические белки), их называют оксифильными.

Основные или щелочные красители (гематоксилин, метиленовый синий, азур) связываются с базофильными (кислыми) компонентами ткани (нуклеиновые кислоты ядра, рибосомы).

Нейтральные или стандартные красители представляют собой смеси кислых и щелочных красителей (гематоксилин и эозин). Их называют нейтрофильными. Для сохранения препарат заключают в канадский бальзам, покрывая объект покровным стеклом.

Для электронной микроскопии материал на специальной сетке контрастируют солями тяжелых металлов, используя соли марганца, кобальта, после чего их просматривают на микроскопе и фотографируют. Изучают микрофотографии.

Гистологические методы позволяют установить локализацию определенных веществ или биохимических процессов в тканевых и клеточных структурах. Также используют гистоферментные реакции, при этом помещают срезы в раствор субстрата, и специального вещества, способного образовать конечный продукт реакции в виде окрашенного осадка.

Для некоторых клеток и органелл характерны ферменты – маркеры. Например, для лизосом – кислая фосфатаза, для митохондрии – сукцинатдегидрогеназа и цитохромоксидаза, для эндоплазматической сети – глюкозо-6-фосфатаза.

Для иммуногистохимии используют реакции, основанные на специфическом взаимодействии меченых антител с тканевыми антигенами.