МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.

Современные методы исследования тканей и клеток используют достижения физики, химии, биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии. Это стало возможным в связи с созданием новых приборов и технологий – различных типов микроскопов, компьютерной техники, рентгеноструктурного анализа, авторадиографии, электрофореза и хроматографии, разделение и культивирование клеток, получение гибридов и гибридом и др. Однако, несмотря на такие разнообразные методы, гистология в своей основе является морфологической наукой, объектами исследования которой служат живые и фиксированные клетки и ткани.

Основными методами изучения строения животных и растительных клеток и тканей является световая микроскопия. Современные световые микроскопы обеспечивают разрешение (возможность наблюдать две точки раздельно) порядка 0,2 мкм и дают максимальное увеличение в 2000-2500 раз. Для контрастности микрообъектов их окрашивают после фиксации. Фиксация сводится к закреплению прижизненного строения исследуемого объекта.

К фиксирующим средствам относят формалин (5-20%), этиловый спирт, осьмиевую кислоту.

Окрашивание производят различными методами в зависимости от задач исследования.

К световой микроскопии относят фазово-контрастную, флуоресцентную, ультрафиолетовую, интерференционную и микроскопию в темном поле.

Фазово-контрастная микроскопия используется для исследования прозрачных бесцветных живых объектов (клеток и тканей). Этот метод обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. В результате становятся видны в черно-белом изображении все структуры, различающиеся по показателю преломления.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. При флюоресценции атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход в нормальное состояние происходит с испусканием света, но с большей длиной волны.

Препарат просматривают в ультрафиолетовых или фиолетовых и синих лучах.

Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80ºС.

Вторичная флюоресценция вызывается специальными красителями – флюорохромами (акриноранжевый, родамин, флюорецин и др.). Например, при обработке препаратов акриновым оранжевым ДНК в клетке имеет ярко-зеленое, а РНК – ярко-красное свечение.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на применении коротких ультрафиолетовых лучей с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние при этом составляет 0,1 мкм. Изображение регистрируется на фотопластинке или на люминесцентном экране.

Микроскопия в темном поле. Используется специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на темном поле. Используется этот метод для наблюдения живых объектов, для изучения кристаллов в моче.

Интерференционная микроскопия. Для количественного определения массы ткани используется интерференционный микроскоп, а для изучения рельефа поверхности клеток – дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского).

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект, другой минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. При этом участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. После количественной оценки изменений определяют концентрацию и массу сухого вещества. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и деления (митоз, мейоз).

Поляризационная микроскопия является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра: один (поляризатор) между пучком света и объектом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменять направление пучка света.

При этом проявляется свойство некоторых органических структур по разному преломлять поляризованный свет вдоль различных оптических осей в связи с особой ориентацией своих молекул (анизотропия). Например, коллагеновые волокна и миофибриллы при изменении оси вращения фильтров проявляются как светящиеся.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используется поток электронов в вакууме с более короткими, чем в световом микроскопе длинами волн. При напряжении в 50000В длина волны электромагнитных колебаний равна 0,0056 нм.

Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть 0,002 нм, т.е. в 100000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Однако практически оно составляет 0,1-0,7 нм. В настоящее время в гистологических исследованиях используют трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ). Просвечивающие электронные микроскопы позволяют получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта, а сканирующие способны создавать трехмерное изображение, т.е. последовательно прощупывают электронным пучком отдельные точки поверхности.

Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Для изучения деталей строения мембран и межклеточных контактов применяется метод замораживания – скалывания (-160ºС). Метод электронной микроскопии «замораживание» - травление применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После замораживания блок раскалывают кристаллы льда, удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем на участки клеток напыляют тонкую пленку тяжелого металла (например, платины).

Методы замораживания позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксатором.

Сверхвысоковольтная микроскопия. Электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3000000В позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм).

Для изучения структуры макромолекул на атомарном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину волны около 0,1нм (диаметр атома водорода).