В аналитической практике

Ферментативный анализ представляет собой один из основных ана­литических инструментов в международной и отечественной практике научных исследований, современного производственного и сертифика­ционного контроля качества продуктов питания, пищевого сырья и био­логических материалов.

Ферментативный анализ является составной частью энзимологии и аналитической химии и служит для специфического определения веществ с помощью высокоочищенных препаратов ферментов. Cлова одного из основоположников ферментативного анализа Г. Бергмана отражают достоинства обсуждаемых методов: «Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недо­статков и ошибок, т.к. он представляет систему для измерений, которую успешно использует живая клетка уже в течение миллионов лет».

В основе ферментативного анализа лежат природные биохимические процессы обмена веществ, которые воспроизводят in vitro реакция фермента с субстратом, причем в качестве субстрата выступает анализи­руемое вещество пробы. Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях, при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, иденти­фикации и установления фальсификации сырья и продуктов питания являются четыре принципа.

1. Высокая специфичность и достоверность ре­зультатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарности пространственной конфигурации активного цен­тра и субстрата является гарантом достоверности и надежности фермен­тативного метода при исследовании отдельных соединений в многоком­понентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты. При разработке ферментативных мето­дов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наи­большей специфичностью действия, для которых подбираются оптималь­ные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов обычно используют несколько ферментов, которые последовательно фун­кционируют в данной системе.

2. Простые способы подготовки проб, которые ис­ключают потерю исследуемых компонентов. Основная задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы, - по воз­можности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подго­товки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуе­мому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов). Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хоро­шо известные способы подготовки проб, такие как разбавление, фильт­рация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция, обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных слу­чаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крах­мал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.

3. Простая и быстрая процедура измерений, кото­рая исключает использование дорогостоящего обо­рудования. В большинстве ферментативных определений исполь­зуют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, коферменты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плот­ности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. Через определенный промежуток времени повторно из­меряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптичес­ких плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Лам­берта-Бера рассчитывают концентрацию С, г/л, искомого соединения:

, (3.8)

где (Е₂ - Е₁)_опыт - разница конечной и начальной оптической плотности в кювете с пробой;

(Е₂ - Е₁) - разница конечной и начальной оптической плотности в кювете без пробы;

V - общий объем реакционной смеси, мл;

М - молярная масса искомого соединения, г/моль;

F - фактор разведения пробы;

ε - молярный коэффициент экстинкции (например, кофермента НАДФ/НАД при λ=340 нм, ε =6,3 );

d - толщина кюветы, см;

n - объем пробы, добавляемый в кювету, мл.

В большинстве ферментативных методов прямому фотометрическо­му контролю доступно измерение таких вспомогательных компонентов тестовой системы, как коферментов НАД⁺/НАДН или НАДФ⁺/НАДФН. Количество восстановленных или окисленных коферментов прямопропорционально количеству искомого соединения. Система конечных зна­чений с фотометрическим измерением результата настолько надежна, что служит в качестве стандарта для оценки других методик. Для проведения ферментативного анализа используется стандартное оборудование, ко­торое имеется практически в любой производственной лаборатории: спектрофотометры или фотометры с интервалом измерений от 325 до 800 нм; кюветы для фотометрических измерений, мерные пипетки и до­заторы, весы, центрифуга, рН-метр, термостат, фильтры и т.д.

4. Высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения сле­довых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов (г/л): этанол - 0,001; ацетоальдегид - 0,001; лимонная кислота - 0,002; глицерин - 0,001; D-глюкоза - 0,002; D-сорбит - 0,001; лактоза - 0,005; нитраты - 0,001.

Области применения ферментативного анализа на практике многооб­разны. Это и производственный контроль, и контроль качества готовой про­дукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого продукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.